鸡毒支原体的分离和巢氏PCR鉴定研究

• 作 者: 刘华栋
• 机 构: 西南大学
• 出 处: 西南大学
• 发表日期: 2009年期
• 关键词: 鸡毒支原体 巢氏PCR 质粒

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)是引发鸡的慢性呼吸道病(Chronic respiratorydisease,CRD)的病原菌,能够引起鸡的咳嗽、流鼻液、呼吸道啰音、和气囊炎等呼吸道疾病。此病易传染,常引发鸡群的群体发病,但死亡率不高,常常是隐性带菌鸡,导致蛋鸡产蛋率下降,蛋的孵化率变低,给养禽业造成严重的损失。针对重庆地区24个养鸡场中的疑似感染病例进行病原分离培养,病料在25%的青霉素溶液中浸泡24h后,取出200μL于改良后添加了醋酸铊的Hartleys培养基增菌培养,2-3天后观察可见长出油煎蛋样外观菌落,瑞氏染色镜检有细小球形、短杆状和不规则的蓝色菌体,由此可初步认定分离物为支原体。经生化反应,分离菌能分解葡萄糖产酸,添加酚红的液体培养基颜色也由红变为黄色。此菌能够吸附红细胞,与MG-S6株血清反应,其代谢抑制价在1:80-1:1280之间,确认为MG阳性。从17株分离物中筛选出来9株鸡毒支原体进行初步研究。用primer premier 5.0引物设计软件对鸡毒支原体分离物保守序列,即16S/3S rRNA基因间隔区的序列设计两对引物,分别扩增577bp序列和其内部283bp序列,做巢氏PCR鉴定。通过对PCR条件的探索,改变条件以至于达到最好的扩增结果。首次扩增可见较暗的目的条带,然后用首次扩增的产物经过500倍稀释作为模板进行第二次扩增,电泳结果可见明亮的目的条带。在此实验中对照组均无目的条带。由此可以将本实验分离的重庆地区鸡毒支原体疑似株鉴定为鸡毒支原体分离株。然后利用限制性内切酶RasI对第二次扩增产物片段进行限制性片段长度多态性分析,鸡毒支原体分离物经电泳分析可显示两种不同的酶切图谱,全部分离菌株均表现255/28型,即片段上只有一个RsaI位点,被酶切为255bp和28bp两个片段,说明鸡毒支原体在基因型上不存在差异。用目前国内外检测和提取细菌质粒的方法对鸡毒支原体进行研究,先参照碱裂解法配制试剂对鸡毒支原体培养物进行抽提,然后用国内成熟提取细菌质粒的抽提试剂盒检验抽提,经电泳分析,两种方法结果相同,均无任何条带,而参照组均可见到几条大小不一致的条带,初步判定鸡毒支原体中无质粒或者此方法特异性较差,不能提取MG的质粒。