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胶原蛋白是动物体内含量最为丰富、分布最为广泛的蛋白质之一,具有良好的生物活性和物理性质,使其可作为很好的生物医用材料。胶原蛋白肽是胶原蛋白的水解产物,具有氨基酸序列(Gly-X-Y),富含-NH2,-OH等亲水基团而具有良好的保湿性,抗氧化性,促进细胞生长和促进伤口愈合。本课题首次以EDC和NHS为交联剂,将可溶于水的胶原蛋白肽接枝到羧甲基壳聚糖、羧丁酰壳聚糖和羧甲基卡拉胶上,考察了反应过程中会影响实验结果的因素,从而得到最佳反应条件,并研究了所得的三种胶原蛋白肽多糖衍生物的生物活性,具有创新性。本论文具体研究内容如下:
1.采用EDC和NHS为交联剂,将可溶于水的胶原蛋白肽接枝到羧甲基壳聚糖、羧丁酰壳聚糖和羧甲基卡拉胶上,制备出羧甲基壳聚糖-胶原蛋白肽、羧丁酰壳聚糖-胶原蛋白肽和羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽。通过单因素实验,以所得产物取代度为指标,考察胶原蛋白肽与多糖衍生物的摩尔比、反应温度、反应时间等因素对三种胶原蛋白肽多糖衍生物的取代度的影响,确定制备高取代度的羧甲基壳聚糖-胶原蛋白肽、羧丁酰壳聚糖-胶原蛋白肽和羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽的最佳反应条件。
2.研究了所制备的三种胶原蛋白肽多糖衍生物的抗氧化活性。实验发现,三种胶原蛋白肽多糖衍生物均有抗氧化活性。探讨了胶原蛋白肽多糖衍生物的取代度、分子量以及浓度对OH自由基、DPPH自由基清除率的影响。产物的取代度越大、浓度越高,则其自由基清除能力越强。当DS=0.45,浓度为15mg/ml,分子量为0.90×104时,羧甲基壳聚糖-胶原蛋白肽(CMC-CP)的·OH清除率值为39%,DPPH·清除率值为23%;当DS=0.51,浓度为14mg/ml,分子量为0.95×104时,羧丁酰壳聚糖-胶原蛋白肽(NSC-CP)的·OH清除率值为44%,DPPH·清除率值为24%;当DS=0.48,浓度为20mg/ml,分子量为1.33×104时,羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽(CKC-CP)的·OH清除率值为43%,DPPH·清除率值为21%。
3.通过细胞培养,研究了三种胶原蛋白肽多糖衍生物对鸡胚成纤维细胞的生长影响。在低浓度(10ppm、50ppm、100ppm和500ppm)条件下,三组胶原蛋白肽多糖衍生物对鸡胚成纤维细胞的生长均有促进作用,随着胶原蛋白肽多糖衍生物取代度的增加促进作用也增强。在浓度为100ppm时,胶原蛋白肽多糖衍生物对鸡胚成纤维细胞的促进作用最强,然而随着浓度进一步增加,浓度达到1000ppm时,成纤维细胞的生长受到了抑制。因此,高浓度的胶原蛋白肽多糖衍生物溶液不利于成纤维细胞生长,当胶原蛋白肽多糖衍生物的浓度为100ppm时,最有利于成纤维细胞的生长。
4.通过动物实验,研究了羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽对大鼠深Ⅱ度烧伤伤口愈合的影响。用5%羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽溶液处理的伤口在14d左右能基本愈合,愈合率达89%,并且无任何不良反应。病理学检查也证明经羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽处理过的伤口,其肉芽组织和上皮细胞的生长较快,伤口的愈合时间也明显快于其他两组。结果表明,羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽对伤口愈合有促进作用。