论文部分内容阅读
一、研究背景
缺血性脑血管病是一种很常见的神经科致残、致死疾病，近几十年来随着人们年龄的增长和生活模式的改变，其发病率越来越高。急性缺血性脑卒中在各个年龄段都可以发生，儿童、青年期发病率低，围产期孕妇较高，而50岁后每十年发病率将增加一倍。
脑缺血再灌注后细胞死亡的确切机制尚存在争议。然而，已有动物实验和临床的研究表明细胞的死亡是通过坏死和凋亡两种途径进行的，坏死主要见于缺血区域的中心区，而凋亡则出现在缺血半暗带区。在缺血中心区，由于毛细血管内白细胞和血小板粘附、微血栓形成导致血管堵塞，血流停止。“无复流现象”导致组织缺血缺氧，细胞不可避免的发生坏死。在缺血半暗带区，仍有少量的血液流过，组织在短时间内尚能通过少量氧气和营养物质得以存活，因此在这个时期只要脑血流恢复，细胞很大程度上就可以生存。然而，随着时间延长和ATP的消耗，细胞将最终发生死亡。
在急性缺血性卒中发生后马上给予溶栓治疗，可以取到很好的效果，因此“时间就是大脑”越来越被人们所接受。目前为止采用重组组织型纤溶酶原激活剂rt-PA进行静脉内溶栓的疗法，在出现症状后的3小时内溶栓是最有效的，也是大家所公认的时间窗。通过影像学的帮助，也有临床研究表明在6-9小时内溶栓，患者也同样可以取得益处。亚低温是目前为止有肯定效果的神经保护措施，它保护神经元的分子机制尚不清楚，可能与降低代谢率、减少兴奋性递质释放、降低能量消耗、减低血管通透性、减轻水肿有关。
基于上述的理论和研究成果，本实验旨在探讨亚低温疗法是否能延长大鼠急性脑梗塞溶栓治疗时间窗。我们采用线栓法制作脑缺血模型而不采取栓子栓塞法，是因为栓线退出实现再灌注时，可以考虑为理想状态下的完全溶栓，这就避免了栓子栓塞法溶栓的不完全性以及栓塞剂的毒性作用对实验的干扰。这样亚低温就可以作为单独的因素研究。
二、研究目的
1、亚低温能否减少脑梗死体积。
2、亚低温能否上调Bcl-2和下调Bax、Caspase-3的表达，减少细胞凋亡。
3、亚低温疗法能否延长大鼠急性脑梗塞溶栓治疗时间窗。
三、实验过程
1、动物
健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠70只，体重280～330g。
2、动物模型的制作
线栓法建立大鼠大脑中动脉的局灶性脑缺血模型。大鼠麻醉后，分离并暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，游离ECA主干及分支，结扎ECA，电凝ECA的分支，结扎翼腭动脉。于ECA残端剪一切口，将栓线插入大脑中动脉起始端。待缺血时间到后，把鱼丝线拉回到ECA的主干中，实现再灌注。假手术组鱼丝线插入深度为13mm，其余步骤同实验组。
3、实验分组
实验组分为脑梗死体积测量组即TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)组和组织学观察组，每组各30只；每组又分为常温缺血组和亚低温缺血组；常温缺血组和亚低温缺血组又根据缺血3、6、9小时再灌注24小时随机各分为3个亚组，每个亚组5只。假手术组的分组，组织学观察组(常温组5只，亚低温组5只)。常温缺血3小时再灌注24小时组记为NT3h，常温缺血6小时再灌注24小时组记为NT6h，常温缺血9小时再灌注24小时组记为NT9h；亚低温缺血3小时再灌注24小时组记为HT3h，亚低温缺血6小时再灌注24小时组记为HT6h，亚低温缺血9小时再灌注24小时组记为HT9h。
4、温度的调控
手术过程中常温组用电取暖器维持肛温在37℃～38℃。亚低温组在缺血后立即采用喷洒酒精和电扇降温的方法在10分钟内使肛温降至30℃，相应于脑温33℃。缺血3、6、9、小时的亚组分别维持亚低温3、6、9小时后，实施再灌注，然后把大鼠转移到温度为5℃的房间里，使大鼠体温调节在肛温30℃，维持24小时。
5、脑梗死体积测量
大鼠腹腔麻醉后，迅速剪开胸腔暴露心脏，经左心室用肝素化生理盐水快速灌注，随后立即断头取脑，从脑额极开始，每间隔2mm作一冠状切片。用TTC染色，梗死区不着色，正常脑组织着红色。固定后根据苍白区观察梗死灶范围。采用佳能数码相机拍照，然后用Adobe Photoshop计算每张切片的梗死灶面积，根据公式V=2(A1+A2+…An)计算梗死体积，其中2为切片厚度，A为梗死面积。
6、免疫组化
经左心室用肝素化生理盐水快速灌注，随后立即断头取脑，取大脑视交叉前缘始向前的2mm厚冠状切片，固定后常规脱水、透明、石蜡包埋、连续冠状切片。相邻切片分别作Bax、Bcl-2和Caspase-3免疫组化染色。切片脱蜡至水，分别滴加一抗(Bcl-2、Bax、Caspase-3的兔多克隆抗体)，滴加生物素化山羊抗兔IgG，滴加试剂SABC，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。胞浆着色呈棕黄色为阳性细胞。每张切片于高倍镜(×400)下将缺血灶周边区皮质和纹状体的5个视野计数。 7统计学分析采用SPSS for Windows Ver．11.5统计软件包对数据进行统计学处理。结果用(x±s)表示，P<0.05认为有统计学意义。脑梗死体积：各亚组采用单因素方差分析。免疫组化细胞计数：常温组和亚低温组采用单因素方差分析，实验组和假手术组采用秩和检验。
四、结果
1、脑梗死体积
脑梗死体积HT3h明显减小NT3h、HT6h明显小于NT6h、HT9h明显小于NT9h(P<0.01)；亚低温组：HT3h明显小于HT6h、HT6h明显小于HT9h(P<0.01)；常温组：NT3h明显小于NT6h(P<0.01)、NT6h与NT9h没明显差别(P>0.05)。
2、Bax阳性细胞数
各亚组与假手术组比较均有明显差异(P<0.01)。HT3h明显小于NT3h、HT6h．明显小于NT6h、HT9h明显小于NT9h(P<0.01)，常温组：NT3h组明显小于NT6h组(P<0.01)、NT6h组与NT9h组无差别(P>0.05)，亚低温组：HT3h组明显小于HT6h组(P<0.01)、HT6h组明显小于HT9组(P<0.01)。
3、Caspase-3阳性细胞数
各亚组与假手术组比较均有明显差异(p<0.01)。HT3h明显小于NT3h、HT6h明显小于NT6h、HT9h明显小于NT9h(P<0.01)，常温组：NT3h组明显小于NT6h组(P<0.01)、NT6h组与NT9h组无差别(P>0.05)，亚低温组：HT3h组明显小于HT6h组(P<0.01)、HT6h组明显小于HT9组(P<0.01)。
4、Bcl-2阳性细胞数
各亚组与假手术组比较均有明显差异(p<0.01)。HT3h明显多于NT3h、HT6h明显多于NT6h、HT9h明显多于NT9h(P<0.01)；常温组：NT3h组明显多于NT6h组(P<0.01)、NT6h组明显多于NT9h组(P<0.05)，亚低温组t HT3h组明显小于HT6h组(P<0.01)、HT6h组明显小于HT9h组(P<0.01)。
五、结论
1、亚低温减少脑梗死体积。
2、亚低温上调Bcl-2和下调Bax、Caspase-3的表达，减少细胞凋亡。
3、亚低温疗法延长大鼠急性脑梗塞溶栓治疗时间窗。