【摘 要】
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植物的真核翻译起始因子(Eukaryotic translation initiation factor 5A, eIF5A)在多种生物学过程中起重要的作用,例如起始蛋白质的合成,参与mRNA的翻译及延伸,调控细胞程序
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植物的真核翻译起始因子(Eukaryotic translation initiation factor 5A, eIF5A)在多种生物学过程中起重要的作用,例如起始蛋白质的合成,参与mRNA的翻译及延伸,调控细胞程序性死亡和增强植物的胁迫耐受能力等。本研究利用PCR技术,从小黑杨(Populus simonii×P. nigra)叶片总cDNA中克隆得到2条杨树真核翻译起始因子基因的同源基因(PsneIF5A2/4)。基因序列分析显示,这2条基因(PsneIF5A2 和 PsneIF5A4)的开放阅读框(ORF)均为483bp,共预测编码160个氨基酸。氨基酸序列分析,eIF5A在各个物种间高度保守。系统进化树结果表明杨树PsneIF5A2/4与拟南芥AteIF5A1是直系同源基因。氨基酸序列多重比较结果表明这两条基因序列彼此相似度为98%。构建亚细胞定位表达载体pTH2-PsneIF5A2/4-GFP,利用洋葱表皮进行亚细胞定位分析,结果显示PsneIF5A2/4蛋白均定位于细胞核和细胞质中。利用实时荧光定量PCR分析PsneIF5A2/4在杨树不同组织中的表达水平,结果表明PsneIF5A2/4在根、茎、叶及花序中均有表达,其中在成熟叶片中转录水平最高。分别用ABA, CdCl2, CuSO4, NaHCO3, ZnSO4,甘露醇,NaCl,和PEG6000胁迫小黑杨幼苗,通过荧光实时定量PCR检测不同胁迫下小黑杨叶片中PsneIF5A2/4的表达变化,结果显示上述胁迫均能诱导PsneIF5A2/4的表达,尤其是重金属胁迫和盐处理,同时PsneIF5A2/4也参与了小黑杨ABA的信号传导途径。构建酵母表达载体pYES2-PsneIF5A2/4,转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)尿嘧啶营养缺陷型菌株INVScl,通过比较转基因菌株和空载菌株在NaCl, CdCl2, CuSO4, NaHCO3, ZnSO4,山梨醇,H202胁迫下的生长状况,结果显示在非生物胁迫下转基因菌株存活菌落数高于非转基因菌株,尤其是CuSO4, CdCl2, NaCl胁迫最为显著,推测杨树PsneIF5A2/4基因具有增强酵母菌对重金属胁迫及盐胁迫的抵抗能力。构建植物表达载体pROKII-PsneIF5A2,通过农杆菌介导法转化拟南芥,比较在CuSO4和NaCl胁迫下野生型拟南芥和转基因拟南芥的生长情况。结果表明转基因拟南芥比对照有更高的发芽率,胁迫后的植株鲜重和叶绿素含量也显示转基因植株更高。在CuSO4和NaCl胁迫下,测量野生型和转基因拟南芥植株的生理指标,结果表明PsneIF5A2转基因拟南芥表现出增强超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性,并降低了丙二醛(MDA)含量和相对电导率。利用DAB、NBT以及Evans blue染色检测胁迫下野生型和转基因拟南芥的ROS清除能力,结果表明PsneIF5A2转基因拟南芥具有更强的抗重金属和盐胁迫的能力。
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