【摘 要】
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莱氏绿僵菌（Metarhizium rileyi）是一种重要的昆虫病原真菌,具有极大的应用前景。莱氏绿僵菌感染宿主昆虫后,通过伪装躲避昆虫免疫系统的识别,并分泌毒蛋白或次生代谢物等毒力因子到宿主血淋巴中,这些毒力因子可通过破坏和攻击宿主免疫系统从而使宿主昆虫致死。但是目前对于莱氏绿僵菌感染宿主昆虫后分泌的具有免疫抑制作用的毒力蛋白研究较少,对其作用机理还不是很了解。因此鉴定莱氏绿僵菌中具有免疫抑制
【基金项目】
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国家自然基金（31772220）；
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莱氏绿僵菌（Metarhizium rileyi）是一种重要的昆虫病原真菌,具有极大的应用前景。莱氏绿僵菌感染宿主昆虫后,通过伪装躲避昆虫免疫系统的识别,并分泌毒蛋白或次生代谢物等毒力因子到宿主血淋巴中,这些毒力因子可通过破坏和攻击宿主免疫系统从而使宿主昆虫致死。但是目前对于莱氏绿僵菌感染宿主昆虫后分泌的具有免疫抑制作用的毒力蛋白研究较少,对其作用机理还不是很了解。因此鉴定莱氏绿僵菌中具有免疫抑制活性的蛋白并揭示其功能,将有助于我们理解莱氏绿僵菌感染昆虫后与宿主昆虫先天性免疫系统相互作用的机理,并对将来通过遗传改良等手段提高莱氏绿僵菌的毒力应用于生产实践中具有重要的指导意义。为了鉴定这些具有免疫抑制效应的毒力蛋白,我们实验室前期提取了被莱氏绿僵菌感染后的棉铃虫的血清,进行蛋白组学分析。我们从检测到的一些真菌分泌蛋白中选择c14115基因进行深入的研究,实验结果如下:1、基因克隆与序列分析根据莱氏绿僵菌cDNA克隆得到c14115基因全长序列。该基因的开放阅读框长852bp,编码283个氨基酸,蛋白质分子量为29.847kDa,等电点为9.08,无跨膜结构域,具有一个信号肽。对其空间结构进行预测,c14115基因编码的蛋白质空间结构主要为α螺旋、β折叠。该蛋白与绿僵菌属亲缘关系很近,与蝗绿僵菌（Metarhizium acridum）同源蛋白最为相似,高达50.16%。2、载体构建并得到突变株构建 pCAMBIA0380-Split-marker-A 载体和 pCAMBIA0380-Split-marker-B 载体,通过Split-marker基因敲除法结合农杆菌转化成功得到Δc14115敲除突变株。随后构建c14115基因回补载体pPK2-Sur-c14115,进行农杆菌转化和筛选后获得Δc14115cp回补突变株。3、突变菌株生长发育分析对莱氏绿僵菌野生型、Δc14115、Δc14115cp突变株进行萌发率、生长速率、产孢率测定,结果表明c14115基因的敲除不会影响莱氏绿僵菌的生长,该基因与生长发育无关。4、突变菌株毒力分析对莱氏绿僵菌野生型、Δc14115、Δc14115cp突变株自然感染棉铃虫幼虫存活率和半致死时间测定,实验结果表明Δc14115突变株自然感染棉铃虫的死亡速度明显减慢,死亡数量减少,半致死时间比野生型延长24h。说明敲除c14115基因能明显减弱莱氏绿僵菌的毒力,该基因在莱氏绿僵菌毒力方面发挥重要作用。5、c14115基因能够抑制宿主昆虫酚氧化酶原激活反应用Δc14115突变株感染棉铃虫,然后检测宿主昆虫血淋巴中酚氧化酶的活性。结果显示,c14115基因的缺失明显降低了莱氏绿僵菌对宿主昆虫酚氧化酶原激活反应的抑制能力。这一结果表明c14115基因能够抑制宿主昆虫酚氧化酶原激活反应。综上所述,本研究揭示了莱氏绿僵菌c14115基因的功能。研究结果加深了我们对莱氏绿僵菌致病机理的理解,并为将来利用遗传改良技术提高莱氏绿僵菌的毒力提供了潜在的靶标基因。
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