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多环芳烃(PAHs)是持久性有机污染物(POPs)的一种,分子中含有两个或两个以上苯环的碳氢化合物,多数具有“三致”效应,即致癌性、致畸性和致突变性,可通过生物累积及食物链传递给海洋生物,给生态环境和人体健康带来极大危害,目前己引起各国环境科学家的极大重视。2011年欧盟委员会发布Regulation (EC) No835/2011法规提出以苯并(a)芘(BaP)、苯并(a)蒽(BaA)、苯并(p)荧蒽(BbF)和(?)(Chr)4种多环芳烃总含量作为食品中PAHs限量的新评价标准。本论文选择我国沿海重要经济贝类菲律宾蛤仔(Rudi tapes philippinarum)为研究对象,利用数字基因表达谱和基因克隆表达分析研究了菲律宾蛤仔在PAHs胁迫下解毒代谢的分子机制：研究了PAHs对菲律宾蛤仔不同组织累积含量、解毒代谢酶和相关基因以及损伤效应的影响,初步探讨了PAHs在菲律宾蛤仔体内蓄积规律和毒性效应,筛选基于菲律宾蛤仔的用于海洋PAHs污染评价的生物标志物；并且通过对胶州湾、莱州湾近海养殖水环境PAHs的含量分析以及基于菲律宾蛤仔的双壳贝类PAHs生物监测分析,验证了生物标志物的有效性,也为评价PAHs对海洋生物毒性效应、保障水产品质量安全和监测海洋环境PAHs污染提供理论基础。1菲律宾蛤仔在PAHs胁迫下解毒代谢分子机制的研究本章首先利用数字基因表达谱(DGE)技术分析了BaP (1 μg/L)胁迫15天时菲律宾蛤仔消化盲囊组织差异基因表达情况,对照组和染毒组分别获得了10508312和11414297条clean reads,将clean reads上传至NCBI SRA文库(accession number: SRP034889);将clean reads与本实验室已完成拼接的菲律宾蛤仔转录组文库unigene进行拼接比对,比对率分别为53.27%和52.22%；通过DGE序列比对分析,共筛得差异表达基因145条,其中上调基因58条,下调基因87条；经GO功能聚类分析以及KEGG通路分析显示,差异基因主要涉及机体生长发育、抗氧化代谢、细胞凋亡以及解毒代谢机制；运用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术，选取5条差异表达关键基因(热激蛋白22、谷胱甘肽过氧化物酶、Mantle gene 6、皮连蛋白3、假定蛋白)以及8条非差异表达解毒代谢关键基因(芳烃受体、热激蛋白90、热激蛋白70、环氧化物水解酶、二氢二醇脱氢酶、磺基转移酶、谷胱甘肽S转移酶、超氧化物歧化酶)验证了DGE结果可靠性。通过RACE和RT-PCR技术获得菲律宾蛤仔热激蛋白70(HSP70)、热激蛋白90(HSP90)基因的cDNA全长序列,其中HSP70全长2336 bp(GenBank Accession Number: KJ569079), HSP90全长2839 bp (GenBank Accession Number:KJ569080);序列分析表明HSP70基因含有51 bp的5’端非编码区、335 bp的3’端非编码区和1950 bp的开放阅读框,开放阅读框编码650个氨基酸；HSP90基因含有107 bp的5’端非编码区、554 bp的3’端非编码区和2178 bp的开放阅读框,开放阅读框编码726个氨基酸；同源性分析显示2种基因的蛋白序列与其它双壳贝类的HSP具有较高的同源性；系统进化树分析发现,两者均与其它双壳贝类亲缘关系最近,与虾蟹等节肢动物次之,而与硬骨鱼类和高等脊椎动物亲缘关系较远；组织特异性分析发现HSP70与HSP90在菲律宾蛤仔消化盲囊、鳃、闭壳肌和外套膜中均有表达,两者均在消化盲囊和鳃中表达量较高；并且通过qRT-PCR技术初步研究了HSP70和HSP90在菲律宾蛤仔PAHs解毒代谢中的功能。2菲律宾蛤仔在PAHs胁迫下生物标志物筛选技术的研究本章以菲律宾蛤仔为研究对象,将其暴露于PAHs(混合比例BaP:BbF:Chr:BaA=1:1：1：1；染毒梯度：0、0.05、0.5、5 μg/L) 21d,分别于0、1、3、6、10、15、21d取样,之后停止染毒,进行PAHs消除实验,分别于22、24、27、31、36d取样,取样组织为鳃、消化盲囊、闭壳肌。测定了PAHs在4种组织中的累积含量,研究了PAHs在菲律宾蛤仔体内的蓄积特征与消除规律,结果表明,各处理组不同组织中PAHs的累积含量在染毒实验时间内呈逐渐升高趋势,呈现时间-剂量效应,在同一染毒浓度下,相同组织中4种PAHs累积含量的顺序基本为Chr>BaA>BaP>BbF;不同组织中PAHs蓄积含量的顺序基本为消化盲囊>鳃>软体部>闭壳肌。消除实验开始后,PAHs的累积含量显著下降,基本在31d趋于稳定,实验结束后中、高浓度PAHs处理组中PAHs累积含量仍然显著高于对照组。整个实验过程中,对照组无显著变化。为了研究PAHs在菲律宾蛤仔体内的毒性效应,取染毒和消除实验中的鳃和消化盲囊组织,测定了以下几种解毒代谢酶及相关基因(i)Ⅰ相解毒代谢酶(AHH、DD、EH)和Ⅱ相解毒代谢酶(GST、UGT、SULT); (ⅱ)抗氧化防御酶相关指标(总抗氧化能力、SOD、GSH/GSSG); (ⅲ)生物大分子损伤(DNA链断裂、蛋白羰基化、脂质过氧化)解毒代谢关键基因表达(PgP、AhR、HSP90、ARNT、EH、DD、GST、SULT、SOD)。结果表明,不同浓度处理组鳃和消化盲囊组织中所有指标均被不同程度诱导,都具有明显的时间-剂量效应,其中消化盲囊组织比鳃变化明显。依据PAHs累积含量与不同指标之间的相关性分析,选取相应的指标作为评价海洋PAHs污染的生物标志物。3基于菲律宾蛤仔的胶州湾、莱州湾PAHs生物监测技术的研究胶州湾(红岛、营海)、莱州湾(广利港、下营港)近海不同季度现场取样(3月、6月、9月、12月)结果表明,胶州湾营海站点的表层海水与沉积物中PAHs污染较严重,而莱州湾广利港的PAHs亏染情况要比下营港严重；各站点中6月和9月的PAHs污染情况较严重；菲律宾蛤仔消化盲囊中AH、GST和SOD酶活力、DNA碱解旋、HSP90、DD和GST的mRNA基因表达与PAHs含量具有较好的一致性,为筛选胶州湾、莱州湾PAHs污染监测的有效生物标志物提供了理论依据。