【摘 要】
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本文主要研究的是肉桂醇脱氢酶。肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素合成途径的关键酶之一,它作用于木质素单体生物合成的最后一步。它能催化几种肉桂醛(cinnamaldehydes,如芥子醛、
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本文主要研究的是肉桂醇脱氢酶。肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素合成途径的关键酶之一,它作用于木质素单体生物合成的最后一步。它能催化几种肉桂醛(cinnamaldehydes,如芥子醛、香豆醛和松柏醛等)直接生成木质素单体的前体物质(芥子醇sinapyl alcohols、香豆醇p-coumaryl alcohols和松柏醇coniferyl alcohols)。
本实验的目的是通过分子生物学和生物化学的方法研究植物毛白杨中木质素合成途径所包含的酶及其基因,研究这些相关酶的结构、功能和分类等。在IPTG的诱导下目的蛋白得到大量表达,并通过Ni2+柱亲和层析的方法纯化出可溶性PtCAD蛋白。PtCAD蛋白能够催化肉桂醇和肉桂醛类化合物之间的转化,通过检测反应前后吸光值的变化分析了PtCAD催化松伯醛的反应。研究毛白杨肉桂醇脱氢酶(CAD)基因在原核生物中诱导高效表达的最适IPTG浓度、诱导表达最适时间;金属Ni离子螯合一步纯化过程中最适咪唑浓度;毛白杨肉桂醇脱氢酶(CAD)最适温度,最适pH,最适缓冲液浓度,金属离子、EDTA对其活性有重要影响;以及Km值和Vm。利用凝胶层析的方法进一步纯化PtCAD蛋白,合并、浓缩蛋白,点晶体,探索了蛋白结晶的条件。
本文中得到的相关基因和蛋白为进一步了解木质素代谢途径提供了大量的材料和方法。文章中的一系列实验包括原核表达纯化、活性分析、蛋白结晶条件搜索等为研究木质素代谢途径提供了可行的方法。
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