蛋白质指纹图谱技术在肝纤维化早期诊断的实验研究

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目的:应用蛋白质指纹图谱(ProteinChip array technology)这一新技术,来检测肝纤维化早期血清的微量蛋白质的变化,旨在发现早期诊断肝纤维化的无创的、敏感的、特异的方法,为预防、诊断和治疗肝纤维化提供理论依据和检验指标。 方法:本项研究采用SD大鼠50只,其中随机抽取6只为对照组,44只为实验组,各组均为雌雄各半。实验组从第一天开始皮下注射40%CCl<,4>植物油溶液,按每百克体重0.5ml,以后每隔四天皮下注射40%CCl<,4>,0.3ml/100g,共注射14次,第53天停止。同时,每天以30%乙醇灌胃,0.5ml/100g体重,并给与79.5%单纯玉米面+20%猪油并混以0.5%胆固醇饲料。对照组与实验组同时同剂量注射植物油,每天用蒸馏水灌胃,0.5 ml/100g体重,正常饲料喂养。实验组成模后,依靠病理分期分为肝纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、期。采集大鼠动脉血后,立即放入4℃冰箱静置2h,4℃3000r/min离心20 min,分离血清后,-80℃保存。使用时取出血清样品,置冰盒上融化后,按照要求处理样品后,在ProteinBiological System Ⅱ质谱仪处理,收集数据。采用贝克曼库尔特公司Bekman-Lx20全自动生化分析仪测定实验各组大鼠的肝功能:总蛋白(Total protein,TP)、丙氨酸转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸转氨酶(Asparateaminotransferase,AST)的数值。采用放射免疫法测定实验各组大鼠的肝纤维化四项:透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)、Ⅲ型前胶原(Procollagen Type Ⅲ,PCⅢ)、层粘连蛋白(Laminin.LN)、Ⅳ型胶原(Collagen Type IV,C-IV)。数据处理采用SPSS14.0版软件进行统计学处理,数据以均数±标准差表示,组间采用完全随机设计单因素方差分析检验,P<0.05表示对比组间差别有统计学意义;检测指标与临床分期相关性比较采用Pearson Correlation检验。 结论: 1、本实验成功的复制了肝纤维化大鼠的动物模型。 2、肝功能随着肝纤维化的加重而逐渐恶化。丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)各组之间比较,差异均具有显著性,这可能与CCI<,4>对肝脏的持续刺激、损伤有关,但ALT、AST升高只能提示肝脏受损,不能代表有肝纤维化。ALT、AST均与肝纤维化程度呈正相关,说明随着肝纤维化程度加重,脚、AST的数值是在逐步增加的。 3、肝纤维化四项对于中晚期肝纤维化有诊断意义。Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、透明质酸(HA)在肝纤维化Ⅲ、Ⅳ期(中晚期)才有明显升高,与正常组相比较有统计学意义;Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)、层粘连蛋白(LN)在肝纤维化Ⅳ期才有明显升高,与正常组相比较,有统计学意义;说明肝纤维化四项指标对肝纤维化的早期(Ⅰ、Ⅱ期)诊断意义不大。肝纤维化四项均与肝纤维化程度呈正相关,说明随着肝纤维化程度加重,肝纤维化四项的数值是在逐步增加的。 4、蛋白质指纹图谱技术对于早期肝纤维化有诊断意义。质荷比为4203蛋白质在肝纤维化第Ⅳ期(早期肝硬化)时明显减少;质荷比为4658蛋白质在肝纤维化第1期时明显增高,在正常组以及肝纤维化Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期无表达或表达很低,有统计学意义,说明在早期肝纤维化其有表达;质荷比为7400蛋白质在正常组没有表达,在肝纤维化第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期时明显增高,有统计学意义,说明在肝纤维化发展过程中均有表达。质荷比为7400蛋白质肝纤维化程度呈正相关,说明随着肝纤维化程度加重,质荷比为7400蛋白质的表达是在逐步增强的,本实验表明这三组蛋白质可以作为新的诊断指标,来诊断肝纤维化,尤其是早期肝纤维化。 5、通过本实验可以表明:蛋白质指纹图谱技术较原有的肝纤维化诊断指标在肝纤维化的早期诊断方面,更有意义、更为敏感。本实验只是初步研究,所测出的蛋白质的定性、定量以及如何结合临床需要进一步的研究。
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