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背景:肝脏缺血再灌注损伤是肝脏外科手术以及肝脏移植中经常遇到的问题,目前预防肝脏缺血再灌注损伤的发生,减轻其损伤程度的措施主要有缺血预处理及药物预处理。探讨预处理保护肝脏缺血再灌注损伤的机制,寻找预处理所启动的保护性通路及相关关键分子,对于肝脏缺血再灌注损伤的防治具有重要意义。在因缺血缺氧等因素所致的细胞内质网应激过程中,发生的未折叠蛋白反应对于恢复细胞的正常功能具有重要作用,其中涉及内质网应激信号分子的激活及其下游众多信号通路的传递。前期研究中我们发现,衣霉素诱导的内质网应激预处理能够减轻大鼠肝缺血再灌注损伤,在细胞缺氧复氧模型中,内质网应激预处理同样表现出了保护性的作用。为了进一步探讨内质网应激预处理对肝缺血再灌注损伤保护作用的机制,我们进行了本研究。实验方法与结果:1、首先,我们建立了大鼠肝脏缺血再灌注损伤的模型,并采取腹腔注射内质网应激诱导药物衣霉素的方式进行预处理,通过Western Blot的方法检测内质网应激相关分子伴侣的表达水平,结果验证了内质网应激预处理对肝缺血再灌注损伤的保护作用,并发现这种保护作用与内质网应激信号分子IRE1α的激活有关。2、为了进一步探讨相关机制,我们建立了HL-7702肝细胞缺氧复氧损伤的模型,并观察内质网应激预处理对肝细胞缺氧复氧损伤的保护作用,结果表明,内质网应激预处理同样能减少缺氧复氧引起的肝细胞凋亡,为深入探讨相关机制构建了良好的平台。3、在细胞模型的基础上,我们通过免疫共沉淀的方法,检测内质网应激预处理时,与IRE1α相结合的分子伴侣,结果发现,细胞骨架蛋白RACK1及蛋白激酶AMPK在细胞发生内质网应激时与IRE1α共同结合形成复合物。4、为了进一步研究在细胞发生内质网应激的情况下,IRE1α、RACK1与AMPK之间的相互作用,我们使用衣霉素处理Hep G2细胞诱发内质网应激,Western blot结果显示:内质网应激预处理后,细胞内磷酸化的IRE1α、RACK1及磷酸化AMPK的水平明显升高,提示这三种蛋白形成复合物并活化的过程中伴随IRE1α及AMPK的磷酸化。在使用si RNA沉默表达IRE1α后,细胞发生内质网应激时,AMPK的磷酸化水平未受影响,提示AMPK的磷酸化不依赖于IRE1α/RACK1复合物的形成,在与IRE1α/RACK1结合之前已发生磷酸化。5、为了更直观的观察IRE1α、RACK1及AMPK的相互作用,我们对内质网应激预处理后的细胞进行免疫荧光检测,结果表明细胞发生内质网应激时,IRE1α、RACK1及磷酸化的AMPK在细胞内共同定位,可能作为互相结合的复合体在细胞发生内质网应激时发挥生物学作用。6、为了验证RACK1与IRE1α的结合是否为IRE1α激活的必要条件,进而发挥调控下游信号通路的作用。通过构建RACK1的si RNA载体,并转染Hep G2细胞,观察RACK1沉默表达后对于内质网应激及细胞功能的影响。结果发现:当RACK1被沉默表达后,内质网应激预处理对于细胞缺氧复氧损伤的保护作用明显减弱,表明RACK1可能发挥分子开关作用,调控着IRE1α的激活及下游信号通路的调控,包括IRE1α活化后作为核酸内切酶参与剪切XBP1 m RNA以及作为激酶参与凋亡抑制蛋白Bcl-2的磷酸化活化。结论:本研究在动物及细胞模型的基础上,观察到内质网应激预处理对动物肝缺血再灌注损伤及细胞缺氧复氧损伤的保护作用,发现IRE1α通路的激活可能是实现这种保护作用的关键,通过免疫共沉淀及免疫荧光技术,首次发现细胞发生内质网应激时,IRE1α、RACK1及磷酸化的AMPK能够形成蛋白复合体,在细胞内共同定位并发挥作用,与减少缺氧复氧损伤造成的细胞凋亡密切相关。其中,RACK1与IRE1α的结合是IRE1α活化并形成复合体实现功能的基础,AMPK在磷酸化后与IRE1α/RACK1结合,调控下游信号分子的磷酸化。IRE1α/RACK1/分子开关的激活对于减轻肝细胞缺氧复氧损伤,恢复细胞内环境稳定,减少细胞凋亡具有重要意义,能够作为保护肝脏缺血再灌注损伤的分子靶点。