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造血是人体最重要的生理过程之一,造血过程必须被精确的控制以满足人体正常的生理需求,它涉及造血干细胞的自我更新、定向分化成各链系祖细胞并继续分化发育成多种具有不同形态和功能的成熟血细胞。红系分化是其中重要的分支。MicroRNAs(miRNAs)是近年来新发现的一类非编码的调节性RNA分子,已被认为是多细胞生物基因表达转录后水平调控的一种普遍方式。随着miRNAs数量的不断增加和功能的深入阐明, miRNA所介导的转录后调控已被公认为真核生物基因表达调控网络的重要组成成分之一,并可与转录因子、表观遗传调控因子等协同作用,共同完成复杂生命活动的调节。其中,miRNA对红系分化的调控受到越来越多的瞩目。MiR-144就是其中之一。但miR-144在人造血红系分化过程中的作用和机制还尚不完全清楚。本研究旨在通过检测miR-144在K562红系分化中的调节作用,进一步阐明miR-144调控人红系分化的机制;构建了miR-144真核表达载体,为大量寻找miR-144更多靶基因,为筛选稳定表达miR-144的K562细胞株、构建miR-144慢病毒奠定基础。本研究采用氯化高铁血红素(hemin)诱导人慢性髓系白血病细胞系K562可实现在体外模拟红系分化过程,使用real-time PCR检测mir-144表达;利用体外合成的寡核苷酸(mimic-144)转染K562细胞,检测过量表达miR-144对红系分化的影响;通过软件预测鉴别若干个miR-144的候选靶基因,把这些候选基因3’UTR区包含miRNA结合位点的序列克隆入pMIR-REPORTTM萤火虫荧光素酶报告基因终止密码子下游,与miR-144成熟体共转染293T细胞后检测报告基因的表达情况。用Western blot在K562细胞中验证miR-144调控红系分化的靶基因。并检测K562细胞红系分化过程中靶基因的表达;以正常人基因组DNA为模板扩增包含miR-144前体在内的序列,将人miR-144(has-miR-144)基因克隆到真核表达载体pmR-mCherry,构建了miR-144真核表达载体。再将pmR-mCherry-miR-144瞬转293T、K562细胞real-time PCR检测其表达情况。研究取得了以下主要结果:1. Hemin诱导K562细胞向红系分化,γ-globin表达升高,说明诱导成功。miR-144的表达呈明显上升趋势(P<0.05),提示miR-144对红系分化发挥着重要作用。在K562细胞中过表达miR-144后,发现血红蛋白合成增加(γ-globin表达升高)及红系特异的表面分子CD235a的表达都明显上升,说明过表达miR-144可促进红系分化。2.发现包含有RB 3’UTR的报告基因的表达可以被miR-144明显抑制,把结合位点顺序突变后,这种抑制作用随之消失。在K562细胞中过表达miR-144后,Western杂交显示pRB、tRB的水平都明显降低。这些结果确定RB是miRNA-144直接的靶基因。3.发现在hemin诱导K562向红系分化过程中,pRB、tRB的表达呈先略上升后明显下降的趋势,pRB/GAPDH灰度值最低为:12h 0.092±0.007(P<0.05以0h参照)。说明miR-144可能通过抑制RB而使红系分化后期细胞周期调控的减弱,进而产生成熟红细胞。4.构建了mir-144的真核表达载体pmR-mCherry-miR-144,经酶切鉴定正确,测序结果与GenBank上公布的一致。通过real-time PCR检测miR-144在293T细胞中过表达>1500倍(P<0.01);在K562细胞中,过表达>150倍(P<0.05)。综上所述,RB是miRNA-144直接的靶基因,miR-144通过抑制pRB而使红系分化后期细胞周期调控的减弱,进而产生成熟红细胞,促进红系分化;构建的miR-144的真核表达载体pmR-mCherry-miR-144,为下一步寻找更多miR-144靶基因,以及筛选稳定表达miR-144的K562细胞株奠定了基础。