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禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎和传染性喉气管炎是鸡群常见的四种呼吸道疫病。它们的发病症状和剖解病理变化相似,病死率较高,给养鸡业带来严重的经济损失。因此,对于四种疫病的鉴别诊断对防控具有重要意义。本研究是在传统基因芯片技术的基础上结合不对称PCR技术,将生物素标记的不对称PCR扩增产物与寡核苷酸芯片杂交,然后与辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)包被的链霉亲和素反应,用二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)对该杂交体系显色后,阳性信号能够以肉眼可见的棕色斑点呈现。该研究建立的可视化寡核昔酸基因芯片技术可以对禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡传染性喉气管炎进行同时鉴别诊断,为鸡呼吸道疫病的临床诊断提供了新的技术。1.AIV的NP基因重组质粒的构建及寡核苷酸探针的设计根据Genbank中收录的基因序列,对AIV的保守基因NP,设计一对特异性引物,目的片段的长度为272 bp。以分离株H9为材料提取RNA,经反转录得到cDNA。然后以cDNA为模板,经PCR扩增获得NP基因扩增产物。将所获得的PCR产物经胶回收后与pMD19-T载体连接,然后转化到大肠杆菌DH5a,经PCR扩增和核酸序列测定鉴定,成功克隆出AIV-NP基因的重组质粒；同时成功复苏本实验室前期保存的NDV的F基因、IBV的N基因和ILTV的TK基因的冻干重组质粒菌。以AIV-NP、NDV-F、IBV-N和ILTV-TK靶基因核酸序列片段的正义链为模板,用Oligo7.0软件设计两条寡核苷酸探针,长度为40 bρ左右,Tm值为80℃左右,探针经BLAST分析,确定各探针的特异性良好。2. AIV-NDV-IBV-ILTV共检可视化芯片的构建及条件优化基因芯片的制备：用微阵列芯片喷样系统晶芯(?)Smart ArrayerTM 16在尼龙膜上喷制芯片。喷制前先将尼龙膜在超纯水中浸泡30 mmin待干燥后,将寡核苷酸探针与点样缓冲液充分混合,调整探针到合适浓度后,将探针点制到芯片上,待探针完全固定后,在紫外灯下交联30 min,然后将制备好的芯片在4℃下密封保存。不对称PCR扩增技术：优化生物素标记的上游引物与未标记的下游引物的浓度比例,提高扩增的循环次数,控制模板浓度,用高浓度的琼脂糖凝胶在低电压条件下检测扩增的单链情况。结果表明,在反应体系中当生物素标记的上游引物与下游引物在10：1时,所获单链产物最多。芯片制备与检测技术条件的优化：对芯片制备和芯片检测技术中的各项检测条件进行优化。结果表明：当喷样次数为1次；探针浓度为25 μ M；杂交时间为1 h；杂交温度为50℃；浓度为1.0mg/mL Streptavidin HRP Conjugate稀释2000倍;DAB显色时间为5 min时,芯片检测技术的结果最佳,确立了共检芯片技术检测的标准条件。3. AIV-NDV-IBV-ILTV可视化共检可视化芯片的质量评价本研究对构建的AIV-NDV-IBV-ILTV共检可视化芯片进行了特异性、敏感性和保存期研究。结果表明,本研究所构建的芯片特异性良好；敏感性试验结果显示最低可检测出靶基因浓度为1.0×10-5μ g/μl；随机抽取保存不同时间的3张芯片进行检测,结果该芯片在保存180 d时仍可检测；采用本研究所构建的可视化芯片技术和实验室常规的RT-PCR/PCR技术同时对采自川渝地区的96份临床组织样品进行检测,结果两种方法的检测结果符合率为100%。本研究构建的AIV-NDV-IBV-ILTV共检可视化芯片,为鸡病诊断提供了新的技术。