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背景： 胚胎着床是哺乳动物生殖过程的一个重要环节，也是决定妊娠成功与否的关键。胚胎的着床包括胚胎滋养层细胞定位、粘附、穿透子宫内膜基底膜直至胚胎包埋于基质中等过程。研究表明胚胎着床时滋养层细胞向母体子宫内膜的粘附和侵入与恶性肿瘤的转移都属于细胞的侵袭性行为，体外共培养研究发现小鼠胚胎滋养层细胞甚至展现出比恶性肿瘤细胞更强的侵袭性。滋养层细胞的侵袭要向前伸出板状伪足，需要细胞快速地发生体积和形状的改变，这就与水通道蛋白（AQPs）介导的跨膜水转运过程密不可分。AQPs是近二十年发现的一类可以介导水分子跨膜转运的蛋白。研究证明AQPs介导的跨膜水转运促进细胞形状的改变及促使细胞向前运动，在细胞迁移过程中起到关键作用。其中，水通道蛋白3（AQP3）属于AQPs家族中的水甘油通道蛋白，他们不仅仅可以介导水的跨膜转运，还可介导一些线性分子（如甘油、尿素等）的跨膜转运。研究发现AQP3介导的水及甘油转运分别参与恶性肿瘤细胞的迁移及增殖过程。作为国内较早研究AQPs在生殖领域的研究者，我们的前期研究发现AQP3参与促进小鼠早期胚胎的发育，在早期囊胚AQP3高表达于囊胚滋养细胞，那么AQP3是否参与胚胎滋养细胞侵袭子宫内膜的过程呢？如果是，其具体作用机制如何？ 目前关于AQPs在胚胎着床的方面的机制研究极少，特别是在与胚胎滋养层细胞侵袭性的研究国内外尚未见文献报道。本研究首先建立小鼠子宫内膜与小鼠囊胚体外共培养模型，模拟胚胎体内着床的过程，添加外源性HB-EGF，研究胚胎滋养层细胞中AQP3表达与HB-EGF的关联，应用AQP3水转运抑制剂CuSO4，研究AQP3介导的跨膜水转运胚胎滋养层细胞侵袭过程有何作用，进一步应用EGFR、ERK细胞内信号转导通路的药理学阻滞剂来研究其具体的作用通路，为AQP3参与胚胎滋养细胞侵袭过程及其具体作用机制提供直接证据，从而寻找可能提高IVF-ET胚胎种植率的有效方法，并提供可能应用于反复种植失败的治疗靶点，为攻克IVF-ET中的一大难题提供新的思路，对生殖医学的进一步发展具有一定的意义。 内容： 第一部分 肝素结合表皮生长因子样生长因子促进小鼠胚胎着床及水通道蛋白3在小鼠胚胎的表达 目的： 验证肝素结合表皮生长因子样生长因子（HB-EGF）是否可以促进小鼠囊胚对子宫内膜的粘附与扩展，及能否促进小鼠囊胚滋养层细胞AQP3的表达。 材料与方法： 对实验KM小鼠予孕马血清促性腺激素（PMSG）联合绒毛膜促性腺激素（HCG）制备控制性超促排卵（COH）模型，使其交配受孕，收集妊娠第4天（D4）囊胚与小鼠子宫内膜细胞，建立小鼠囊胚与小鼠子宫内膜细胞共培养模型。在共培养系统中呈浓度递增加入不同浓度（0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml）的HB-EGF，倒置显微镜下连续观察各组胚胎滋养层细胞粘附、侵袭子宫内膜的情况，在共培养36小时和72小时分别统计胚胎粘附率、向外扩展率，分析其与HB-EGF浓度的关系；Western blot法测定在不同浓度HB-EGF组，囊胚滋养层细胞AQP3的蛋白表达水平，分析其与HB-EGF的表达关联。实验重复3次，取平均值进行计算，采用SPSS21.0统计软件进行统计分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。 结果： 1、共培养系统中HB-EGF浓度为10ng/ml时，囊胚粘附率和扩展率与0ng/ml HB-EGF组无统计学差异；当HB-EGF>=20ng/ml时，随着共培养系统中HB-EGF浓度的升高，粘附率和扩展率逐渐升高。 2、不同浓度HB-EGF组囊胚滋养层细胞AQP3的蛋白表达水平不同，10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml HB-EGF组诱导AQP3的表达分别为0ng/ml HB-EGF组的1.51、2.08、2.30、2.77倍,即随着HB-EGF浓度增大，AQP3的表达逐渐增强。 结论： 1、HB-EGF促进胚胎对子宫内膜的粘附与扩展需要达到一定的浓度阈值，当达到阈值后，HB-EGF对小鼠囊胚对子宫内膜的粘附与扩展促进作用随着HB-EGF浓度升高而增强。 2、HB-EGF可以诱导小鼠囊胚滋养细胞层AQP3的表达，随着HB-EGF浓度升高而AQP3的表达水平逐渐升高。 第二部分 水通道蛋白3在肝素结合表皮生长因子样生长因子诱导的胚胎着床中的作用及机理研究 目的： 研究AQP3是否直接参与小鼠囊胚滋养层细胞侵袭子宫内膜的过程，以及HB-EGF通过何种信号转导途径诱导滋养层细胞AQP3的表达。 方法： 1、建立小鼠囊胚与子宫内膜共培养系统，对相同HB-EGF浓度（100ng/ml）共培养体系分别施加不同浓度的AQP3抑制剂CuSO4（0、50、250、500uM），以既不添加HB-EGF也不添加CuSO4为空白对照组（UNTR），统计各组的囊胚粘附率与扩展率，Western blot法检测各组囊胚AQP3的表达水平。 2、在100ng/ml HB-EGF共培养系统中,在2、5、15、60分钟时间点以western blot法检测HB-EGF的受体EGFR及其下游信号转导分子ERK的磷酸化水平，再以不同浓度加入EGFR特异性抑制剂PD153035（0、1、5、10uM）和ERK特异性抑制剂U0126(0、5、10、20uM)，western blot法分别检测EGFR和ERK的磷酸化水平。 3、以适宜抑制浓度分别加入PD153035（1uM）、U0126(10uM)或不加入抑制剂PD153035、U0126至共培养系统中，以既不加HB-EGF也不添加PD153035、U0126为空白对照（UNTR），即分四组进行研究：只添加PD153035（1uM）或U0126(10uM)、只添加HB-EGF（100ng/ml）、既添加PD153035（1uM）或U0126(10uM)同时也添加HB-EGF（100ng/ml）和既不加HB-EGF也不添加PD153035或U0126的空白对照（UNTR），Western blot法检测各组AQP3的表达水平，统计各组囊胚粘附率与扩展率，分析AQP3与囊胚粘附率与扩展率的关系。 实验重复3次，取平均值进行计算，采用SPSS21.0统计软件进行统计分析，P＜0.05认为差异具有统计学意义。 结果： 1、随着CuSO4浓度升高，囊胚粘附率与扩展率逐渐下降；各组AQP3表达水平无统计学差异。 2、100ng/ml HB-EGF处理5分钟后，EGFR和ERK的磷酸化达到峰值，且持续60分钟；加入EGFR特异性抑制剂PD153035和ERK特异性抑制剂U0126后，EGFR和ERK的磷酸化呈浓度依赖性被抑制。 3、加入EGFR抑制剂PD153035后，与对照组（UNTR）对比100ng/ml HB-EGF诱导AQP3的表达水平从1.81fold（倍数改变）下降至1.19fold(PD1530351uM+HB-EGF100ng/ml)、0.64fold(PD1530351uM),囊胚粘附率从78.72±2.75%（100ng/ml HB-EGF）下降至45.55±2.55%(PD1530351uM+HB-EGF100ng/ml)、27.42±4.2%（PD1530351uM），囊胚扩展率从62.61±5.09%（100ng/ml HB-EGF）下降至36.82±7.46%(PD1530351uM+HB-EGF100ng/ml)、19.39±1.9%（PD1530351uM）；加入ERK抑制剂U0126后，与对照组（UNTR）对比100ng/ml HB-EGF诱导AQP3的表达水平从1.72fold下降至0.51fold(U012610uM+HB-EGF100ng/ml)、0.13fold(U012610uM),囊胚粘附率从78.72±2.75%（100ng/ml HB-EGF）下降至33.47±2.78%(U012610uM+HB-EGF100ng/ml)、17.25±2.86%（U012610uM），囊胚扩展率从62.61±5.09%（100ng/ml HB-EGF）下降至23.26±1.76%(U012610uM+HB-EGF100ng/ml)、12.18±2.91%（U012610uM）。 结论： 1、小鼠囊胚滋养层细胞AQP3介导的跨膜水转运参与了小鼠囊胎对子宫内膜的粘附与扩展，CuSO4对小鼠囊胚AQP3的表达水平无影响。 2、HB-EGF可引起小鼠囊胚上EGFR受体磷酸化，并引起其下游信号转导分子ERK的磷酸化，进而激活级联信号转导通路。PD153035和U0126可分别阻断HB-EGF对EGFR和ERK的磷酸化。 3、EGFR和ERK抑制剂抑制HB-EGF诱导的小鼠囊胚AQP3的表达水平，随着EGFR和ERK抑制剂浓度的增大AQP3的表达水平逐渐下降，同时小鼠囊胚对子宫内膜的粘附与扩展率逐渐下降，说明HB-EGF/EGFR/ERK/AQP3信号转导通路参与小鼠胚胎着床的调节。