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苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,简称Bt)对鳞翅目、鞘翅目、双翅目直翅目等有害昆虫具有特异的杀虫活性,是一种应用广泛的杀虫微生物。几丁质酶(Chitinase)可水解昆虫中肠围食膜上的几丁质,与其他昆虫毒素联合使用时,有利于其它毒素更好的发挥作用。增效蛋白(Enhancin)是由病毒基因编码的一种磷脂蛋白,不但能增强多种核型多角体病毒对昆虫幼虫的感染力,而且还能提高Bt等其它生物杀虫剂的功效。AaIT是一种昆虫兴奋性神经毒素,具有严格的昆虫选择性毒性,杀虫效率很高。
本实验室分离到2株分别抗鳞翅目和东亚飞蝗的Bt菌株C-33和H-13,并从C-33和H-13菌株中克隆到杀虫晶体蛋白基因,被国际苏云金芽孢杆菌杀虫毒素基因命名委员会命名为cry1Ac19,cry7Ca1。为了提高Cry1Ac19、Cry7Ca1的杀虫活性,将增效蛋白基因(enhancin)和昆虫兴奋性神经毒素基因(AaIT)分别与cry1Ac19、cry7Ca1进行融合。以pQE30质粒为载体,构建了3个重组质粒:含cry1Ac19毒素片段质粒pQE/cry1Ac-toxin,cry1Ac19毒素片段分别与AaIT和enhancin片段融合基因质粒pQE/cry1Ac-toxin/AaIT,pQE/cry1Ac-toxin/enhancin4。将重组质粒转入大肠杆菌M15中,SDS-PAGE检测到3个重组质粒均表达相应蛋白。棉铃虫生测结果表明,融合蛋白Cry1Ac-toxin/AaIT对棉铃虫杀虫活性很低；Cry1Ac-toxin,Cry1Ac-toxin/enhancin4对棉铃虫的LC50分别为80.64μg/mL,11.52μg/mL,后者的杀虫活性比前者提高了近7倍。
利用抗鞘翅目害虫Bt杀虫晶体蛋白质Cry3Aa8基因的启动子,以pHT304为载体,分别构建了含有几丁质酶基因(chitinase)和昆虫兴奋性神经毒素基因(AaIT)的两个重组质粒pHT/P3Aachi、pHT/P3AaAaIT,将这两个重组质粒电转化入H-13菌株。以pQE30质粒为载体,将cry7Ca1毒素片段分别与AaIT和enhancin片段融合,构建2个融合基因质粒pQE/cry7Ca1-toxin/AaIT和pQE/cry7Ca1-toxin/enhancin4。利用重叠PCR技术,以Cry3Aa8结构域Ⅰ基因片段置换Cry7Ca1结构域Ⅰ的基因片段,构建重组基因质粒pQE/cry3Aa/7Ca,将pQE/cry7Ca-toxin/AaIT、pQE/cry7Ca-toxin/enhancin4和pQE/cry3Aa/7Ca分别转入大肠杆菌M15中。SDS-PAGE检测表明,Chitianse和AaIT在H-13中均没有表达；融合蛋白Cry7Ca-toxin/AaIT,Cry7Ca-toxin/enhancin4,Cry3Aa/7Ca在大肠杆菌M15中均得到了表达。毒力生物测定结果显示,与Cry7Ca1相比,融合蛋白对蝗虫的毒力没有明显提高,这说明增效蛋白(Enhanein)、昆虫兴奋性神经毒素(AaTT)及更换Cry7Ca1的结构域Ⅰ均对Cry7Ca1无增效作用。