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禽流感(AI)是由禽流感病毒(AIV)引起的一种禽类感染和/或疾病综合症，主要侵害各种家禽和野禽。AIV具有传播快、感染性高、致病性/致死性强等特点，对养禽业具有巨大的危害性。由于AIV为分节段的负股RNA病毒，病毒能够通过抗原漂移、漂变等方式发生基因间的重组，从而形成新的毒株。病毒的频繁变异为AI的防控和监测带来了极大的困难。传统的病原学、血清学、免疫学检测方法均不能满足快速临床诊断的需要，而PCR、NASBA等分子生物学方法也存在设备成本昂贵、条件要求高等缺点。本研究的目的在于建立一种特异性强、灵敏性高的方法，适用于基层检测AIV的简便、快速检测方法，能够在条件简单的基层单位推广应用。
本研究根据环介导恒等温扩增(LAMP)的原理，建立了H5、H7、H9亚型AIV的快速诊断方法。该方法针对3种亚型AIV HA基因保守区域的序列设计了3套特殊的LAMP引物，并以各AIV的阳性质粒为模板，对反应体系中各个组分的最优反应浓度进行了细致的优化，得到了检测3个亚型AIV的最适LAMP反应体系。本研究还用设计的LAMP引物对3种亚型AIV、NDV、IBV进行了扩增，结果证明，特异的LAMP引物仅对其相应亚型AIV有反应性，对LAMP产物的酶切鉴定也进一步证明了引物的特异性。将3种亚型AIV的阳性质粒进行一系列倍比稀释测定了LAMP方法的灵敏性，结果表明，该方法的最低检测限可达10-6。为了更快更简便的判定反应结果，本研究使用了两种结果判定方法，一是将产物离心后观察白色Mg2+的生成，二是添加了核酸染色用sYBR GREENⅠ荧光染料观察染料颜色的变化。两种方法都无须经过凝胶电泳便可以直观地呈现反应结果。同时，在LAMP反应体系中添加了荧光定量用SYBR GREENⅠ后，在荧光定量PCR仪中对LAMP反应实现了实时监控，并发现LAMP在20min左右便已开始有可检测到的产物形成。
本研究还建立了检测H5、H7、H9亚型AIV RNA的RT—LAMP方法，在LAMP体系中加入AMV反转录酶，一步完成病毒核酸的反转录及扩增。该方法的特异性好，灵敏性高，对H5、H7、H9亚型AIV RNA的最小检测浓度分别达到1ng、10ng、1ng。应用RT—LAMP方法对人工发病的临床分离的脏器和咽肛拭子样品进行了检测，并将结果与RT-PCR及鸡胚病毒分离方法比较。结果表明，在咽肛拭子组中，RT—LAMP与鸡胚病毒分离法的阳性符合率在H5、H7、H9三种AIV攻毒组中分别为96％、93.8％、93.6％；在脏器病料组中，分布为96.4％、84％、88.5％。与RT-PCR方法相比，RT—LAMP方法的分离率更高。
本研究结果表明，LAMP方法对于H5、H7、H9亚型AIV的检测具有较好的特异性和灵敏性，临床样品检测率高，比传统的病毒分离方法更快更简便，和RT-PCR方法相比需要的仪器设备更简单，结果判定更容易，检测成本更低。在进一步优化试验条件后，LAMP适于在基层推广应用。