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目的：近年来生活压力的增加使人们长期处于慢性应激状态,慢性心理应激损伤已成为威胁人们身心健康的超级隐患,精神类疾病抑郁症则是其中一种。慢性心理应激导致海马神经干细胞受损,从而影响学习记忆功能,相关疾病已成为生物学研究界的重要课题。中医藏象学理论认为肝主疏泄,肝通过疏通功能、调节全身气机,使脏腑经络之气、血的运行通畅无阻,维持人体的正常情志活动。情志与“肝主疏泄”的功能密切相关,其功能正常与否在人体情绪及精神活动中扮演着非常重要的角色。肝主疏泄的实质内涵在于条畅全身气机的流畅,调节人体精、气、神、血、水的正常运转,肝的疏泄功能是人体脏腑功能活动的基本形式的概括。中医认为情志失常引起机体气血运行失常,阴阳失衡是情志因素导致疾病发生的基本病机,而气血运行失常与现代病理生理学中心理应激理论关于疾病的认识有很多相似之处,二者对不良情绪诱导或引发疾病的内在机制有许多相似之处。肝失疏泄所致肝郁多由长期情志不畅所致。临床表现以精神抑郁、萎靡不振、胸闷胁胀、不思饮食、失眠多梦、多疑善虑、悲伤欲哭、善长太息为主症,这些症状与慢性心理应激抑郁相似。慢性心理应激与中医肝藏象的疏泄功能,特别是情志内郁导致肝失疏泄、气机郁滞密切相关。可以认为,肝郁即肝失疏泄是慢性应激抑郁症发病的重要环节。临床上肝郁证所表现出的全身应激反应的失调,实际是神经内分泌免疫功能的失调,这可能是慢性应激抑郁症和肝失疏泄之肝郁证共同的病理学基础。因此认为慢性心理应激属于中医情志病因的范畴。研究已经证实,肝主疏泄条畅情志的功能不仅对HPA轴有调节作用,而且对中枢神经机制有调节作用。疏肝解郁法治疗心理应激性病变,已被大量研究成果证实是一种有效的疗法,肝主疏泄能改善慢性应激抑郁模型大鼠海马神经干细胞的损伤,改善情绪活动及学习记忆能力。疏肝方药四逆散通过激活Wnt信号通路,促进海马中的神经干细胞向神经元分化。本团队前期研究发现,四逆散能促使Wnt1、β-catenin的高水平表达,激活经典Wnt信号通路,促进NSCs的增殖与分化。四逆散能明显提高Wnt5a和JNK的表达量,激活非经典Wnt信号通路,认为在NSCs层面上,肝主疏泄主要表现为促进NSCs的迁移与分化。对比干细胞(SCs)与中医先天之精起源、作用和发展规律,许多学者从多个角度发现这两种物质在人体中的作用相似,通过干细胞这一视角对先天之精和肾是先天之精的内涵进行了讨论,干细胞的生理功能与中医的先天之精十分相似,体内干细胞存在的形式与先天之精在体内存在形式也类似。干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多分化潜能的细胞,具有无限分裂能力,能分化成多种细胞,包括神经干细胞。慢性心理应激影响海马神经干细胞的增殖与分化,疏肝解郁法治疗心理应激性病变,已被大量研究成果证实是一种有效的疗法,尤其是改善应激反应对海马的损伤。慢性心理应激损伤属于中医情志内伤病因的范畴,中医藏象理论认为,肝主疏泄调畅气机对于调节人体的情志活动具有重要意义。因此,从海马神经干细胞增殖分化角度研究肝主疏泄对慢性心理应激损伤海马的机制研究,从细胞水平深入阐明肝主疏泄内涵,丰富中医肝藏象及情志病因理论,讨肝肾藏泄互用关系的实质,并为应用调肝治法结合干细胞技术在临床上治疗重大疑难疾病提供理论与实验依据。方法：取8周龄、SPF级、雄性、wistar成年大鼠为研究对象,采用慢性不可预知温和应激(电击、夹尾、禁食、束缚、禁水、冰水游泳,倾斜,燥湿)建立慢性心理应激大鼠模型。观察疏肝方药四逆散对慢性心理应激大鼠的体重,反映快感缺失的糖水消耗实验,反映活动度和空间探索能力的旷场试验及反映学习记忆能力的水迷宫实验的影响；通过电镜观察疏肝方药四逆散对慢性心理应激大鼠海马DG区突触数量及结构变化；通过Westen-blot和RT-PCR方法,观察疏肝方药四逆散对慢性心理应激大鼠的海马DG区与海马神经干细胞增殖分化相关的Wnt信号通路中β-catenin、JNK、Rho信号蛋白表达及β-catenin、Wnt3a、Wnt11、Wnt5a、JNK、Rho基因表达的影响。结果：(一)四逆散对慢性应激抑郁模型大鼠行为学的影响1.体重：30d统计结果与15d一致。空白组体重增长明显大于其余造模组(P<0.05)。2.糖水消耗实验：造模30d,空白组、氟西汀组、四逆散低剂量组糖水偏爱率高于模型组(P<0.05)。3.旷场试验：①造模15d：：空白组总路程、平均速度、中央区停留时间高于模型组(P<0.05)。②造模30d,空白组、氟西汀组、四逆散中剂量组运动总路程、平均速度、中央区停留时间、中央区路程高于模型组(P<0.05)4.水迷宫实验：定向航行潜伏期时间、空间探索120s穿越平台次数无统计学差异(P>0.05)。(二)四逆散对海马DG区突触数量和超微结构的影响电镜观察海马DG区的超微结构发现,空白组可见大鼠海马的突触体数量多、突触结构大,细胞器如线粒体、高尔基体、内质网等结构清晰,突触后致密物相对较厚,神经细胞之间树突形成,在树突中可见大量微管结构,没有线粒体发现空泡变性。模型组在与空白组比较,树突中神经微丝和微管结构有明显的溶解,突触数量明显较少,突触结构明显变小,线粒体发生明显的空泡变性,细胞器结构不清晰。氟西汀组与模型组比较树突微管结构清晰,突触量多且无线粒体空泡,细胞器结构清晰。四逆散低剂量组图中可见神经细胞之间形成的树突,树突之间形成的突触结构数量明显减少,突触结构变短,部分树突中微丝明显减少,出现空染区域,有些线粒体水肿,内嵴变短。四逆散中剂量组图中可见神经细胞之间形成的树突,树突间形成的突触,突触数量有些减少,突触结构明显变小,可见线粒体,没有发现线粒体空泡变性。四逆散高剂量组神经细胞间形成的树突,树突间形成的突触,突触数量增大,突触结构变大,可见线粒体,有些线粒体有少量发生空泡变性,水肿不明显。(三)四逆散对海马DG区β-catenin、Wnt3a、Wnt11、Wnt5a、JNK、Rho基因表达的影响1.Wntll：空白组、氟西汀组、四逆散低剂量组与模型组比较表达升高(P<0.05)2. Wnt5a:空白组、氟西汀组,四逆散低剂量组与模型组比较表达升高(P<0.05)3. Wnt3a:氟西汀组,四逆散低、中、高剂量组与模型组比较表达升高(P<0.05)4.JNK：其余五组与模型组比较表达皆升高(P<0.05)。5.Rho：空白组、氟西汀组、四逆散中剂量组与模型组比较表达升高(P<0.05)。6. β-catenin:氟西汀组、四逆散中剂量组与模型组比较表达升高(P<0.05)。(四)四逆散对海马DG区JNK、Rho、β-catenin蛋白表达的影响1.JNK：空白组、氟西汀组、四逆散低剂量组与模型组比较表达升高(P<0.05)2.Rho：空白组、氟西汀组、四逆散中剂量组与模型组比较表达升高(P<0.05)3.β-catenin:氟西汀组、四逆散中剂量组与模型组比较表达升高(P<0.05)。结论：(一)四逆散对慢性应激抑郁模型大鼠行为学的影响无论是西医抗抑郁药氟西汀,还是中医的疏肝解郁方药四逆散都不能逆转这种因慢性应激致使体重增长缓慢的情况；四逆散低、高剂量组能改善因慢性应激造成的大鼠快感缺失、兴趣减退的抑郁症状；慢性应激达到一定的时间和程度,导致大鼠兴奋性降低,对大鼠的活动度和探索行为均造成影响,调肝中药四逆散可这种抑郁症状,但不同剂量的四逆散改善这种抑郁症状时也不完全相同,表明肝主疏泄功能可改善因慢性应激出现的一些抑郁症状。慢性心理应激对学习记忆的及大鼠海马神经干细胞的损伤跟时间和程度有关,可能跟使用的造模方法、环境、鼠种等也有一定的关系。(二)四逆散对海马DG区突触数量和超微结构的影响本研究结果可表明,具有疏肝解郁功效的四逆散,无论低、中、高剂量,都能改善慢性应激抑郁模型大鼠海马神经干细胞的损伤,增加突触数量、改善突触超微结构的损伤,而四逆散中、高剂量组,特别是高剂量组效果更明显。在促进海马神经干细胞向神经元分化方面,四逆散高剂量组则效果更佳。认为肝主疏泄在神经干细胞的增殖分化中,主要是表现为促进分化。(三)四逆散对海马DG区β-catenin、Wnt3a、Wnt11、Wnt5a、JNK、Rho基因和蛋白表达的影响四逆散不同剂量对基因和蛋白表达的调控虽略有不同,但并无统计学差异,表明四逆散对Wnt通路上相关基因和蛋白的调控与剂量无关。四逆散可促进海马神经干细胞的分化,其促进分化的机制可能通过激活和调控的Wnt通路,促使β-catenin、Wnt3a、Wnt11、Wnt5a、JNK、Rho基因上调,促使β-catenin、JNK、Rho基因和蛋白表达的上调,从而提高了海马神经干细胞向神经元分化的比例。肝主疏泄可部分逆转慢性应激造成的海马损伤,通过应用疏肝药四逆散可改善因慢性应激造成的海马神经干细胞减少,促进海马神经干细胞向神经元分化。而对于肝肾藏泄互用的关系对神经干细胞的增殖分化的调控实质,主要是体现促进神经干细胞的分化。创新点：(一)提出假说：在细胞层面上,认为中医藏象理论中主要藏于肾的先天之精与干细胞相关,而肝藏象中肝主疏泄的功能能促使能促使海马中神经干细胞的分化,肝肾藏泄互用中肝主疏泄的功能不仅是对生殖之精的疏泄,也表现在对神经干细胞的增殖分化的影响,在激活Wnt通路中,主要以激活非经典通路促进海马神经干细胞向神经元分化。(二)通过wistar大鼠的在体动物实验,从神经干细胞增殖分化的调控角度来探讨肝主疏泄、肾主藏精及肝肾藏泄互用关系的实质,为拓展中医藏象理论的研究提供了新的思路。存在的问题与展望：主要通过慢性应激抑郁模型即肝郁模型,结合前期团队的体外实验对海马神经干细胞分化进行了研究,未进行肾虚模型的在体实验研究,药物在体外环境与在体内环境产生药理效存在一定的差异,这是本实验的缺陷。四逆散如何通过Wnt信号通路对海马神经干细胞进行调控,即它们对应的机制还不甚清楚。所以,需要进一步研究Wnt信号通路,确定其组分的功能,四逆散对其组分的调控；四逆散为复方,起作用的为哪位药物,药物中的哪些成分,这些活性成分通过什么途径调节,这些对于有目的的干预神经发生、研究治疗神经系统疾病或损伤的靶点和药物,深入中医理论创新与基础研究,揭示其科学内涵,阐明其科学性,开展创新研究,都有非常重要的意义。