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简单、高灵敏、特异性的检测肿瘤标志物和肿瘤细胞一直都是生命研究以及临床诊断所追求的目标。电致化学发光(ECL)法以其灵敏度高、反应可控性强、仪器设备简单等优点在生物传感研究方面引起了广泛的关注。随着微加工技术的迅速发展，微流控芯片技术已经成为目前最前沿的研究领域之一，与之相匹配的微型化检测系统的开发显得尤为重要。本论文以电致化学发光分析为基础，致力于开发新型生物传感模式和微型化的电致化学发光传感器，以实现对细胞及肿瘤标志物的快速、高灵敏、高通量检测，具体开展了以下5个方面的工作: 1.CdS半导体纳晶/Ru(bpy)32+电致化学发光共振能量转移体系用于肿瘤细胞检测 我们设计了一个新的共振能量转移体系用于细胞表面蛋白的检测。将CdS半导体纳晶固定在玻碳电极表面，并修饰上β-2微球蛋白的抗体，SMMC-7721细胞用钌联吡啶标记，当特异性表达β-2微球蛋白的SMMC-7721细胞和电极表面的抗体之间发生免疫反应时，CdS纳晶和钌联吡啶之间的距离就会被拉近，由于它们之间的光谱重叠很好，因此，它们之间就会发生ECL共振能量转移，即CdS纳晶的ECL光强（500nm）变小，而钌联吡啶的ECL光强(620nm)增强。相对于CdS纳晶，钌联吡啶具有较高的量子产率、较长的激发态寿命，因此它是一种非常高效的能量转移受体。经过计算得到620nm处的增强与500nm处的减小值比可达5.8，表明经过能量共振转移过程之后，信号放大了5.8倍。该体系可以灵敏检测到12.5个细胞/mL，且具有很高选择性。 2.基于64位点电致化学发光微芯片阵列的细胞表面抗原检测研究 将ITO微电极阵列与微流控系统结合，利用CdS NCs/Ru(bpy)32+共振能量转移体系实现了肿瘤标志物以及细胞的同时检测。该芯片由4个微阵列组成，每一个阵列中都含有4根平行的微管道和4根平行的微电极。微管道和电极的方向垂直，因此每一个微阵列中管道和电极的交界处形成了一个检测单元，用USB接口来连接微电极实现即插即用检测。每一个检测单元上都修饰了CdS纳米棒，在这些纳米棒上修饰了各种不同的抗原，然后在相对应的抗体表面修饰钌联吡啶。当发生特异性的免疫反应时，钌联吡啶分子被带到微芯片上不同位点的纳米棒表面，从而发生ECL共振能量转移。利用磁扰动来实现快速的混合，以加快免疫反应速度，可以达到同时检测多种抗原的目的。在此基础上，我们利用竞争免疫法，发展了一种高灵敏的细胞传感方法，它可以检测复杂体系中的多种细胞以及识别细胞表面的多种肿瘤标志物。这种简便的高通量检测芯片，为细胞的生物学研究以及肿瘤标志物的筛选提供了有力的平台。 3.无线双极电极电致化学发光法检测细胞表面受体 当在微管道两端施加一定的电位时，置于这个电场中的金属或半导体带与溶液的界面电位差达到一定的数值后，就会引起溶液中的电活性物质在其两端发生氧化还原反应，这个金属或半导体带即称为双极电极。以钌联吡啶为例，钌联吡啶和三丙胺(TPA)在阳极发生氧化反应，同时氧气在阴极发生还原反应。在进行钌联吡啶的检测中，我们发现叶酸对钌联吡啶的信号有很强的猝灭作用，基于这种高效的猝灭效果以及微型化的ECL技术，我们设计了一种特异性检测细胞表面受体的方法。叶酸受体是一种在肿瘤细胞表面高表达的物质，正常细胞表面很少表达。溶液中的叶酸会与细胞表面受体高特异性的结合，并被胞吞进入细胞，使得溶液中钌联吡啶的ECL恢复，从而达到检测细胞的目的。以高表达和低表达叶酸受体的HL-60细胞和MEF细胞为例，在HL-60细胞中，ECL强度与细胞浓度在21.0到3.28×104个/mL之间呈线性关系，经计算得到每个细胞表面含有的叶酸受体为8.05±0.75×10-18 mol;而对于MEF细胞来说，ECL变化很小，经计算得到每个细胞表面的叶酸受体含量为5.30±0.61×10-19 mol。此外，根据ECL随时间的变化可观测到叶酸的胞吞和胞吐现象。 4.无线双极电极电致化学发光法检测细胞内的mRNA 本工作利用反义DNA做信号识别元素，钌联吡啶(Ru(bpy)32+)结合的硅纳米粒子形成的核壳型结构作为信号识别单元(RuSi@Ru(bpy)32+)来放大ECL信号，报告DNA作为检测RNA的信号来源。由于胞外检测mRNA时会增加其水解的机会，因此，我们将mRNA的识别单元转染进入细胞，用报告DNA来代替mRNA的胞外检测。细胞首先用CdSe@ZnS量子点-反义DNA/报告DNA转染，当细胞内有目标mRNA时，会使得报告DNA从量子点上释放。然后将细胞裂解液通入微芯片中进行定量检测。微芯片传感平台由RuSi@Ru(bpy)32+/反义DNA修饰电极组成。当报告DNA与反义DNA杂交时会使得RuSi@Ru(bpy)32+远离电极表面，从而达到定量检测细胞内mRNA的目的。它对报告DNA的线性检测范围是2.0×10-16 M～1.0×10-11 M。以c-Myc为例，它在MCF-7细胞和LO2细胞内的表达数量分别为2203和13拷贝数/细胞。 5.电致化学发光可视化检测芯片研究 我们设计了一种可视化的双管道电致化学发光微流控芯片，用于前列腺抗原(PSA)的高灵敏成像检测。该微芯片由两个间隔200μm的ITO电极玻璃下片以及双管道的PDMS上片（a和b）组成。它的传感单元由管道a中两根电极及其间隔处组装的PSA一抗构成，检测单元则依靠管道b中钌联吡啶的ECL完成。这种双管道的设计方法能有效的防止样品对ECL试剂的干扰。当没有PSA存在的时候，这两根ITO电极相当于两个独立的双极电极，钌联吡啶ECL信号分别在这两根双极电极的阳极产生。当溶液中有PSA以及Au NPs-PSA二抗复合物存在时，它们就会在管道a的传感界面上形成夹心型的结构，再通过Au的催化沉积作用使得银纳米粒子沉积在两根电极的间隔处。银纳米粒子的存在使这两根电极之间形成电子通路并成为一根完整的电极。这些将使得双极电极的有效长度和导电性增加，表现为驱动钌联吡啶ECL的外加电位大幅度下降，而且ECL发光点有明显的不同。最重要的是在新的驱动电位下，钌联吡啶在这两根双极电极上没有ECL发光。因此，我们可以采用高浓度的钌联吡啶来提高ECL成像的信号。这将使得这种直读型传感器可以用于高灵敏的ECL检测。它对PSA检测的线性范围是1.4～70.0 ng/mL。此外，这种可视化的微芯片还可以用于其它分析领域。