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目的：
世界卫生组织估计,全世界有20多亿人饮用酒精性饮料及7.63亿人诊断为酒精性相关性疾病、紊乱症。乙醇及其在体内代谢的一系列中间产物,对机体组织细胞都会产生直接或间接的毒性作用。长期慢性乙醇暴露会引起机体实质器官病理变化及行为障碍性疾病,导致脑重量变小,大脑萎缩,脑额叶前皮质和其他脑区神经元及胶质细胞密度降低,细胞和白质的缺失,以及永久的认知功能障碍。但其发生的具体机制目前还不清楚。N-甲基-D-门冬氨酸受体(NMDAR)是配体门控Ca2+通道,与中枢神经系统的发育与学习、记忆有密切关系。NMDAR1亚基是NMDA受体的功能亚基,在哺乳动物中枢神经系统内从大脑皮层到脊髓都有广泛分布。本研究在建立小鼠慢性乙醇暴露的动物模型基础上,应用免疫组化和Westernblot技术检测慢性乙醇暴露引起的小鼠大脑皮质神经细胞NMDAR1的表达变化,探讨慢性乙醇暴露引起小鼠大脑皮质神经细胞损伤的病理生理学机制。
实验材料与方法：
一、动物模型的建立及分组；
健康成年(8～9周龄)清洁级昆明系雄性小鼠40只,体质量30～42g,随机分为8组,每组5只。其中第一组为90天正常对照组,第二组为90天10％乙醇(V/V)实验组,第三组为90天20％乙醇(V/V)实验组,第四组为90天30％乙醇(V/V)实验组,第五组为180天正常对照组,第六组为180天10％乙醇(V/V)实验组,第七组为180天20％乙醇(VN)实验组,第八组为180天30％乙醇(VN)实验组。适应性喂养5天后,给予正常对照组小鼠饮用矿泉水(自由饮用),分别给予慢性乙醇暴露实验组小鼠优级纯无水乙醇与饮用矿泉水配制浓度分别为10％、20％、30％的乙醇自由饮用。每日观察各组动物喂养情况及行为变化。
各组实验动物到慢性乙醇暴露动物模型终止时处死动物、取材。动物取材前,采小鼠尾静脉血0.2ml,测血乙醇浓度。取材时,给予小鼠吸入乙醚麻醉后,迅速断头,取出整个脑组织,在冰面上迅速去除小脑和脑干,切取大脑以备HE染色、免疫组织化学染色和Western blot检测应用。
二、实验方法；
应用顶空气相色谱法检测各组小鼠血乙醇浓度,应用免疫组织化学检测各组小鼠大脑皮质神经细胞NMDAR1表达变化及应用Western blot技术检测各组小鼠大脑皮质NMDAR1的表达变化。以正常对照组小鼠大脑皮质作对照,显微镜×400倍下,在大脑皮质区随机选取10个视野,计数细胞总数、阳性细胞数及阳性细胞率。应用Motic Image Advanced3.2图像分析系统计算各组平均积分光密度,测得数据用均数士标准差((x)±s)表示。用SPSS13.0 for Windows进行单因素方差分析,以.P＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
慢性乙醇暴露实验组小鼠出现明显的中毒体征、行为异常,毛发失去光泽、杂乱、稀疏,精神萎靡、易激惹,体重减轻。饮酒90天组,20％、30％乙醇组与正常对照组间小鼠体重增长值差异有统计学意义(P＜0.05),而10％乙醇组与正常对照组间体重增长值差异无统计学意义(P＞0.05);饮酒180天组,10％、20％、30％乙醇组与正常对照组间体重增长值差异均有统计学意义(P＜0.05)。随着饮酒浓度的增加和饮酒时间的延长,慢性乙醇暴露组小鼠血中乙醇浓度也增大,各慢性乙醇暴露组小鼠血中乙醇浓度与正常对照组差异有统计学意义(P＜0.05)。病理学检查显示,慢性乙醇暴露实验组小鼠大脑质软,组织肿胀,脑沟变浅,大脑皮质变薄;小鼠大脑切片HE染色显示皮质神经细胞嗜伊红染色增强,轴突肿胀,尼氏体边聚,脑实质内神经细胞、血管周围间隙增宽,有的神经细胞核深染,染色质固缩,胞质浓缩,可见噬神经细胞现象。免疫组织化学检测结果显示,饮酒90天组,随着饮酒浓度的增加小鼠大脑皮质神经细胞NMDAR1表达阳性细胞数逐渐增多,NMDAR1阳性细胞率逐渐升高,慢性乙醇暴露各组与正常对照组间小鼠大脑皮质神经细胞NMDAR1阳性细胞数、阳性细胞率差异有统计学意义(P＜0.05);饮酒180组各组间统计学分析结果与饮酒90天组统计学分析结果相同,并且90天10％实验组和180天10％实验组比较NMDAR1阳性细胞数、阳性细胞率差异无统计学意义(P＞0.05),90天20％实验组与180天20％实验组比较,NMDAR1阳性细胞数差异有统计学意义(P＜0.05),但是阳性细胞率差异无统计学意义(P＞0.05);90天30％实验组与180天30％实验组比较,NMDAR1阳性细胞数、阳性细胞率都具有显著性差异(P＜0.05)。Western blot检测结果显示,饮酒90天组和饮酒180天组随着饮酒浓度的增加小鼠大脑皮质表达NMDAR1的阳性谱带逐渐增强,各组内相邻谱带的平均积分光密度值的差异都有统计学意义(P＜0.05),并且饮酒90天10％实验组和饮酒180天10％实验组比较、饮酒90天20％实验组与饮酒180天20％实验组比较、饮酒90天30％实验组与饮酒180天30％实验组比较,谱带的平均光密度值都具有显著性差异(P＜0.05)。
结论：
1、慢性乙醇暴露引起小鼠大脑皮质神经细胞NMDAR1表达增强;
2、慢性乙醇暴露引起小鼠大脑皮质神经细胞NMDAR1表达增强的程度与饮酒时间及饮酒浓度相关,饮酒时间越长、乙醇浓度越高,NMDAR1表达的越多。