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目的：
皮肤损伤愈合是一个连续而又复杂的生理过程,其大致可分为三个阶段:急性渗出期、纤维增生期和组织重建期。在急性渗出期,各种类型的炎症细胞,例如中性粒细胞和巨噬细胞,浸润到损伤区域参与清除损伤坏死组织、异物及入侵的病原体等。在纤维增生期,肌纤维母细胞主要参与损伤组织的修复。许多实验证实,在皮肤损伤愈合过程中有各种各样的细胞因子、生长因子和趋化因子的参与。研究表明内源性大麻素系统广泛参与炎症反应。内源性大麻素水解酶主要有两种,即脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)和单酰基甘油脂肪酶(MGL)。MGL是一种重要的内源性大麻素水解酶,其主要作用是水解花生四烯酸甘油酯(2-AG)。有研究证实,MGL在啮齿类动物的脑组织中高度表达,并且在维持内源性大麻素水平方面起到重要作用。到目前为止,尚未发现有关MGL在皮肤损伤愈合过程中的研究。本实验首次研究小鼠皮肤切创愈合过程中不同损伤时间段MGL的表达和分布情况,探讨MGL在皮肤损伤愈合过程中的作用及其应用于损伤时间推断的可能性。
实验材料与方法：
健康成年雄性BALB/c小鼠45只,体质量35～40g,随机分为9组。其中8组为皮肤切创组,另1组为对照组。腹腔注射戊巴比妥钠,背部剪毛处理后,常规手术消毒,在背部中央做一纵行长1.5cm皮肤全层切口,深达筋膜。伤后每只小鼠单独饲养,防止感染,保持12h的昼夜交替生活节律。分别于伤后6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d和14d将小鼠麻醉后脱颈椎处死,取伤口处1.5cm×1.0cm皮肤组织。各组5只小鼠的皮肤样本均分为两部分,一部分用于HE染色和免疫荧光染色,另一部分用于Western blot和real-time PCR检测。对照组5只小鼠麻醉后背部剪毛,不做切创,取相同部位同等大小皮肤。应用免疫荧光,Western blot及real-time PCR技术检测小鼠皮肤切创后不同时间MGL表达变化情况,以非切创小鼠皮肤组织作对照,显微镜×400倍下,在损伤区及损伤周边区随机选取10个视野,计数细胞总数、阳性细胞数及阳性细胞率。应用Scion image软件测各片段的平均光密度值,测得数据用均数±标准差(-x±s)表示。用SPSS13.0 forWindows进行单因素方差分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
正常小鼠皮肤的表皮、毛囊及皮脂腺均表达MGL。皮肤切创后6～12h,在皮肤损伤区及其周边区可见大量中性粒细胞表达MGL;伤后1～5d,MGL阳性细胞主要以巨噬细胞为主;伤后7～14d,MGL主要表达在肌纤维母细胞中。MGL阳性细胞率于5d达高峰。中性粒细胞表达MGL的阳性率于12h达高峰;巨噬细胞表达MGL的阳性率于5d达高峰;肌纤维母细胞表达MGL的阳性率于7d达高峰。经Western blot检测显示,对照组及各个损伤时间段小鼠皮肤都有MGL阳性条带,其中5d为MGL蛋白表达高峰。Real-time PCR结果显示,对照组及各个损伤时间段小鼠皮肤都有MGLmRNA表达,其中5d为表达高峰。
结论：
1、正常小鼠皮肤的表皮、毛囊及皮脂腺均表达MGL。
2、小鼠皮肤切创愈合过程中,中性粒细胞、巨噬细胞和肌纤维母细胞均表达MGL。
3、小鼠皮肤切创愈合过程中,MGL在不同细胞内的表达以及MGL蛋白和基因的表达均具有一定的时间变化规律性,可作为推断皮肤切创损伤时间的依据。