【摘 要】
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钩端螺旋体病(钩体病)是一种由致病性钩端螺旋体(钩体)引起的世界范围内广泛流行的人畜共患的传染病，近年来提供的商业化的钩体病疫苗，主要包括热灭活或福尔马林灭活的钩体全菌
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钩端螺旋体病(钩体病)是一种由致病性钩端螺旋体(钩体)引起的世界范围内广泛流行的人畜共患的传染病，近年来提供的商业化的钩体病疫苗，主要包括热灭活或福尔马林灭活的钩体全菌，只能产生不完全的或短期的免疫。钩体的外膜蛋白(outer membrane proteins，OMPs)位于菌体表面，直接参与细菌与宿主的相互作用，且与外膜脂多糖(LPS)不同，不具有型特异性，成为目前钩体病疫苗开发的热点。与以往的工作不同，本实验首先通过生物信息学的方法分析和诠释钩体外膜蛋白的结构和功能，然后应用较多的免疫学实验方法对这些蛋白进行分析和筛选，得到最有潜力的钩体病高效、广谱疫苗候选者。 随着钩体黄疸出血群赖型赖株全基因组序列测序的完成和释放(http://www.chgc.sh.cn/lep/)，我们发现其中有100多个ORFs编码外膜蛋白。本实验研究的第一部分即首先从这100多个外膜蛋白序列中挑取11个应用基因组学和生物信息学工具进行详细分析，预测结构基因及功能域，为筛选广谱、高效的钩体疫苗做前期的基因分析工作。然后，我们对挑选的这11个钩体外膜基因进行克隆、蛋白表达、纯化和制备多克隆抗体，这11个OMPs在体外培养的有毒、无毒钩体赖株中或其他致病性和非致病性钩体菌株中均有不同程度的表达。用感染了钩体患者的血清对其免疫反应性进行了检测，其中有九个外膜蛋白表现了较强的免疫原性。又通过动物的免疫保护性实验，免疫组化等发现在这9个OMPs中有3个能显著增加被钩体菌攻击后豚鼠的存活率。于是，我们应用免疫学方法从体液免疫和细胞免疫水平分析这3个外膜蛋白提高机体的免疫力的机制。我们通过MAT法检测免疫动物血清中抗体的综合效价，每个蛋白组的MAT阳性率均高于对照组。其中由基因LA0136编码的钩体外膜蛋白组MAT阳性率甚至达到100％。通过T淋巴细胞增殖实验，我们发现由基因LA0136和LA0616编码的外膜蛋白诱导免疫的豚鼠的脾细胞在被特异性蛋白抗原刺激体外培养10天后检测有显著的T淋巴细胞特异性增殖反应，他们的刺激指数与对照组有显著的差异。同时，用ELISA方法检测到蛋白免疫动物血清中特异性的细胞因子IFN-γ和IL-4，IL-10与对照组相比均有不同程度(12％-90％)的增加。这表明此三种基因编码的外膜蛋白有希望成为亚单
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