叶黄素对H2O2诱导的人视网膜Müller细胞氧化应激损伤的干预作用及机制研究

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背景氧化应激是年龄相关性黄斑变性的主要病因之一。叶黄素对年龄相关性黄斑变性的防治有重要作用,但是其抗氧化机制仍不明确。目的研究不同浓度的叶黄素对H2O2诱导的视网膜Muller细胞氧化应激损伤的干预作用及机制研究。方法以对数生长期的人视网膜Muller细胞为研究对象,绘制不同浓度过氧化氢作用下Muller细胞的生长曲线,取H2O2的半数致死率浓度,即160μmol/L。用常规培养的Muller细胞作为空白组,160μmol/LH2O2作用的Muller细胞作为对照组,不同浓度(12.5,25,50mg/L)叶黄素和160μmol/LH2O2作用的Muller细胞作为实验组,加入培养基培养24h,MTT比色法测定不同浓度叶黄素和H2O2对Muller细胞的活性影响;流式细胞仪检测各组的活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)含量;采用实时荧光定量PCR的方法检测各组Muller细胞核因子2相关转录因子2(NF-E2-related factor2,Nrf2)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)和Caspase-3的mRNA含量;用Western Blot方法检测各组Muller细胞胞浆Nrf2、胞核Nrf2、HO-1和Caspase-3的蛋白表达情况。结果MTT比色法检测显示,各组细胞活性比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,实验组细胞活性均明显升高,但低于空白组,差异有统计学意义(P<0.05)。叶黄素浓度与细胞活性呈正相关;流式细胞术结果显示,各组细胞的ROS含量比较差异有统计学意义(P<0.05),与对照组相比,实验组的ROS含量低于对照组,高于空白组,差异有统计学意义(P<0.05),叶黄素浓度与ROS呈负相关;实时荧光定量PCR结果表明,不同剂量叶黄素的实验组Nrf2和HO-1的含量比较差异具有统计学意义(P<0.05),实验组的Nrf2和HO-1含量均高于对照组,低于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05),且随着叶黄素浓度增加,Nrf2和HO-1含量逐渐增加,不同剂量叶黄素的实验组Caspase-3的含量比较差异具有统计学意义(P<0.05),实验组的Caspase-3含量均低于对照组,高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05),且随着叶黄素浓度增加,Caspase-3含量逐渐减少;Western Blot结果表明,各组Muller细胞胞浆蛋白中Nrf2的含量各组均无显著性差异(P>0.05),各组Muller细胞HO-1、Caspase-3和核蛋白中的Nrf2,比较差异有统计学意义(P<0.05),实验组的HO-1和核蛋白中的Nrf2蛋白含量高于对照组,叶黄素浓度与HO-1和核蛋白中的Nrf2蛋白含量呈正相关,实验组的Caspase-3蛋白含量低于对照组,叶黄素浓度与Caspase-3蛋白含量呈负相关。结论叶黄素通过上调Nrf2的表达,使之发生核转位,诱导抗氧化酶的表达,从而抑制氧化应激损伤,下调Caspase-3的表达,最终抑制细胞的凋亡。
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