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磷酸甘露糖变位酶(phosphomannomutase,PMM)催化6-磷酸-甘露糖和1-磷酸-甘露糖之间的转化,1-磷酸-甘露糖进一步形成GDP-甘露糖,参与蛋白翻译后修饰(提供糖基化蛋白寡糖核心)和植物中维生素C(Vc)的合成。在哺乳动物中,PMM基因缺失具有致死表型,而在人类中,该基因突变后引起先天性糖基化不足(inherited glycosylation disorder CDG-Ia)。鉴于该基因的重要生理功能,我们在普通小麦中开展了对该基因的研究。
普通小麦是异源六倍体(AABBDD,2n=42),具有三个亚基因组。基因组大约为16000 Mb,是拟南芥基因组的100倍,水稻基因组的40倍。一般情况下,在水稻等二倍体植物中为单拷贝的基因,在小麦中会有三个部分同源的等位基因。小麦除了基因组比较大,基因个数是二倍体基因三的倍数的特点外,其基因组中的重复序列高达80%以上,大约只有2%的序列编码基因,且与水稻相比较,在小麦中大约25%以上的基因发生了复制。这些特点,为研究小麦的基因带来了一定的挑战。
本研究根据拟南芥、水稻和小麦中PMM基因的结构,采取同源克隆的方法,分离了部分普通小麦及其亲缘种中PMM成员的编码序列。普通小麦中六个TaPMM基因成员分别定位在小麦的第二和四同源群染色体上,根据禾本科植物基因的共线性关系,将基因分别命名为TaPMM-A1、TaPMM-B1、TaPMM-D1(第二同源群),TaPMM-A2、TaPMM-B2和TaPMM-D2(第四同源群)。这六个成员中TaPMM-A2为假基因,其余五个具有完整的阅读框。通过小麦祖先物种二倍体和四倍体中PMM-A2(位于4A染色体)的基因型分析表明,普通小麦中的TaPMM-A2基因来源于四倍体小麦。用水稻、短柄草、小麦祖先物种(A,D and ABgenome)和六倍体小麦(ABD genome)分析表明,在水稻、短柄草中PMM基因为单拷贝,由一个基因座位(PMM-1)编码;而在大麦、小麦祖先物种以及六倍体小麦中,PMM基因为双拷贝,分别由二个基因座位(PMM-1,PMM-2)编码。大麦中两个PMM基因的染色体定位在与小麦第二、四同源群同源的2H和4H染色体上。进化分析表明,在小麦族植物中,PMM基因座位发生了复制,复制发生时间在大麦和小麦分化之前,但在短柄草与它们共同祖先分化之后。
用多重定量PCR技术和半定量RT-PCR技术的研究表明,普通小麦中六个TaPMM成员为组成型表达的基因,所有成员均在旗叶中表达量最高,但不同的成员在各个器官中的表达量并不相同,表达量较高的是PMM-A1、B1和B2。用酵母互补和体外原核表达五个小麦PMM成员的功能试验表明,在小麦中有四个PMM成员具有比较高的PMM活性,结合所有PMM成员器官表达试验表明,在普通小麦中第二同源群的PMM基因起主要的功能。在不同的温度下,重组TaPMM蛋白活性试验表明:TaPMM-D1、D2在30℃下,活性最高,而TaPMM-A1随着温度的升高,活性增加,反应普通小麦中不同的PMM成员的不同特性。用大麦条纹花叶病毒诱导基因沉默试验表明,可用拷贝特异的序列沉默单个的部分同源等位基因的表达,但也存在一定程度的交叉沉默。在普通小麦中减量表达PMM后,小麦叶片中Vc含量降低,表明小麦PMM基因参与了小麦叶片Vc的合成。
本论文的研究首次比较系统地揭示了小麦PMM基因的遗传、进化、生化和生理功能,为进一步明确小麦Vc合成和控制奠定了基础,也为将来研究小麦中Vc参与的小麦抗逆的分子育种研究奠定了基础。同时,本论文研究还探索出了一系列基于毛细管电泳片段分析来确定小麦基因拷贝数目和染色体定位的方法,这对于提高小麦基因功能研究的效率具有积极意义。