论文部分内容阅读
目的：构建含大鼠血小板衍生生长因子C（PDGF-C）基因的pAD-EGFP-PDGF-C的重组腺病毒表达载体，体外转染骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）并观察目的基因蛋白及mRNA表达。方法：通过RT-PCR法从pIRES2-EGFP-PDGF-C真核表达载体中获得PDGF-C目的片段，经BP重组插入中间载体pDONR221，再经过LR重组到pAd/CMV/V5-DEST，构建pAd-PDGF-C-IRES2-EGFP腺病毒载体。酶切及DNA测序鉴定后转染HEK293A包装、纯化，测定病毒滴度后转染大鼠骨髓源性EPCs，应用Real-time qPCR、Western blot等方法检测PDGF-C蛋白及mRNA的表达。结果：核酸内切酶消化及PCR分析证实PDGF-C基因成功插入pAD/CMV/V5-DEST腺病毒载体，转染后荧光显微镜下观察可见绿色荧光蛋白表达,转染48h后Real-time qPCR测定EPCs中PDGF-C含量明显提高（P<0.05），Wester blot检测证实在46kD存在特异性条带。结论：成功构建了大鼠PDGF-C基因的腺病毒表达载体pAD-EGFP-PDGF-C，体外转染大鼠骨髓源性EPCs能高效表达目的基因产物，为后续研究PDGF-C基因功能以及进一步开展基因治疗奠定了基础。