论文部分内容阅读
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种革兰氏阴性的条件致病菌，会引起人类腹泻，主要感染水生动物，导致水生动物多种疾病尤其是气单胞菌败血症的暴发，这种菌的流行已经给水产养殖业带来了严重经济损失。随着科技发展，高通量测序技术精确性不断提高，越来越多的学者选择运用全基因组测序手段来研究细菌。本研究正是采用Illumina Hiseq2000平台对一株强毒力嗜水气单胞菌基因组进行测序并作了相关分析。 细菌能适应多变的环境主要是各种信号转导系统的功劳，在这些系统中双组分系统处于中心地位。Cpx是革兰氏阴性菌中普遍存在的一种重要的双组分系统，由组氨酸激酶CpxA和反应调控蛋白CpxR组成，主要参与膜压力调控。自从在大肠杆菌中发现这个系统，它就成为了研究的热点，其功能在越来越多的细菌中被揭示。然而目前对Cpx系统在嗜水气单胞菌中的功能了解还比较少，因此本文通过构建嗜水气单胞菌株DBHS101的cpxRA双基因缺失突变株△cpx来研究该系统的功能。 论文研究结果如下: 1.提取嗜水气单胞菌DBHS101菌株基因组在Illumina Hiseq2000平台进行测序，测序数据经过预处理、组装得到scaffolds，对得到的scaffolds序列在RAST(RapidAnnotation using Subsystem Technology)平台进行注释，然后分析菌株的系统发育构建进化树，再逐步分析序列的基因岛、插入序列、前噬菌体分布，比对菌株的耐药基因以及毒力基因。菌株大小为4，998,952 bp，GC含量是60.86％，和ML09-119、NJ-35等属于同一个克隆系，基因组包含多个移动元件，其中较为独特的是大小为31.6kb的基因岛，与DNA转移修复有关。此外，在该菌株中还发现一个10.2kb的质粒，质粒上含有移动元件Pre蛋白，这个质粒在气单胞菌中属于首次报道。比对结果显示本株菌可能含有β-内酰胺类、大环内酯类、氟喹诺酮类、酰胺醇类、多粘菌素类药物相关抗性基因;除了T3SS基因簇，该株菌几乎能比对上所有已经报道过的嗜水气单胞菌毒力基因。 2.在完成上述基因组测序后，选取该株菌的CpxR/A蛋白编码序列及上下游序列为对象，利用融合PCR和基因同源重组原理，以自杀质粒pRE112为载体构建缺失57-1879bp序列的cpxRA基因簇突变株Acpx，然后比较缺失株和野生株在生长、生物膜形成、应激耐受及毒力等生物学特性方面的差异。普通PCR及荧光定量PCR结果验证了突变株中cpxRA基因簇片段的部分缺失，表明突变株构建成功;生物学特性研究结果显示，突变株在形态、生长、生物膜形成及毒力等方面与野生株没有显著差异，两者差异主要体现在对某些药物的敏感性和应对高渗透压、十二烷基磺酸钠(sodiumdodecyl sulfate，SDS)及乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)或多粘菌素B刺激上。突变株对头孢唑肟和萘啶酸两种药物相比野生株更为敏感;突变株在0.5 mg/mL SDS急性刺激和5 mg/mL的EDTA慢性刺激下存活率显著高于野生株，而在0.5 mol/L KCl的高渗透压急性刺激和20μg/mL多粘菌素B慢性刺激下则是显著低于野生株的。根据实验结果，Cpx双组分系统对嗜水气单胞菌毒力影响处于次要地位，但对药物敏感性及离子刺激应对方面发挥着重要作用，可以考虑将该系统作为嗜水气单胞菌多粘菌素B耐药株感染的靶位点研究对象。