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本研究主要针对拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)是否具有致病性问题及病木中拟松材线虫和松材线虫(B.xylophilus)的快速检测难题进行研究,利用截枝套管法,用采自不同地方的拟松材线虫接种广州马尾松(Pinus massoniana)以进行致病性测定,并利用巢式多重PCR方法研究拟松材线虫和松材线虫的快速检测技术,取得以下结果:
1.将来自不同地方的7个拟松材线虫种群接种到广州马尾松上,结果表明不同来源的拟松材线虫对广州马尾松的致病力不同。根据致病力的大小将其分为3类:第一类具有较强的致病性,在自然条件下,与松材线虫一样能够致马尾松死亡,包括云南罗平拟松材线虫种群(LPBm)和云南峨山拟松材线虫种群(ESBm);第二类具有潜在的致病性,它们能使马尾松表现出一定的症状,在条件合适的情况下,可能致松树死亡,包括贵州拟松材线虫种群(GZBm)、广东珠海拟松材线虫种群(ZHBm)和广东花都拟松材线虫种群(HDBm);第三类完全没有致病能力,接种这些线虫的马尾松没有表现出任何发病的症状,包含香港拟松材线虫种群(HKBm)和广东佛山拟松材线虫种群(FSBm)。该结果证明我国存在有致病力的拟松材线虫,为我国检疫线虫决策方面提供了重要的依据。
2.应用线虫比较形态学,结合分子生物学技术研究拟松材线虫的种内变异情况。结果发现试验所应用的7个拟松材线虫种群除了雌虫的尾尖突略有差别外,其余形态基本一致。通过比对rDNA-ITS区序列,发现它们相似性很高,相似系数在99.2%~99.9%之间,通过ITS-RFLP电子图谱分析,表明本试验测试的7个不同地区的拟松材线虫种群均属于亚洲型拟松材线虫。
3.通过设计扩增松材线虫和拟松材线虫rDNA-ITS的通用引物BursaF和 BursaR,及特异性引物BxBmTF和BxGSPR,同时采用Matsunaga报道的一条拟松材线虫特异性引物BmGSPR,组成巢式多重PCR反应体系。应用巢式多重PCR技术检测松材线虫和拟松材线虫,结果显示该技术在线虫DNA含量不低于10<'-7>ng时,可以快速鉴定出松材线虫和拟松材线虫,这比常规多重PCR的灵敏性提高了将近10<'5>倍。
4.应用改良的SDS方法,直接从马尾松病木中提取线虫DNA,并通过巢式多重PCR技术成功鉴定出病木中的拟松材线虫和松材线虫。该技术可以成功检测出1—2mg的马尾松病木中的单条松材线虫或拟松材线虫;在5mg、10mg、15mg、20mg的马尾松病木中含有一条松材线虫或拟松材线虫的检测成功率分别为75%、50%、25%、8%;实践中,在松材线虫密度大约为1.2条/g时,检出成功率达到了90%。这种方法极大地提高了松材线虫和拟松材线虫的检测灵敏度,并在一天内可得出检测结果,有望开发成检测试剂盒,在林业生产以及检疫部门具有广阔的应用前景。