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本文根据报道的胡萝卜抗冻蛋白基因afp的cDNA序列及其基因序列分析,设计了核苷酸引物,以胡萝卜基因组DNA为模板,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法扩增到长为1015 bp的片段,测序结果的序列分析表明,该基因片段长为999 bp,含有一个开放阅读框,推测编码332个氨基酸,分子量约为36 KD,与已报道的胡萝卜抗冻基因afp的一致。并以pCAMBIA1300为载体,构建了含有afp基因、CaMV 35S启动子的表达载体p1300-afp,并通过冻融法导入农杆菌EHA105菌株中,获得含有p1300-afp质粒的农杆菌克隆。
以印楝的复叶叶轴为外植体,通过设计正交组合,调整MS培养基中BA、NAA的浓度,进行诱导培养后,获得了印楝愈伤组织的诱导和继代的优化培养条件是:MS+30g/L蔗糖+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L ABA+0.8 g/L琼脂粉,pH 6.0。通过组织培养获得分裂生长快速、结构致密、颗粒性好、可用于遗传转化的印楝胚性愈伤组织。成功建立了印楝植物组织培养及植株再生体系。
采取农杆菌介导的转化方法,将含有植物表达载体p1300-afp的农杆菌与印楝胚性愈伤组织共培养,经过筛选、分化出芽、生根等培养再生植株,并对再生植株进行了PCR检测。结果发现再生植株中含有afp基因的特异条带,获得了转抗冻蛋白基因的印楝植株。