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该研究用重组腺病毒载体将CTLA4Ig基因导入体外培养的真核细胞,采用原位杂交、免疫细胞化学方法来研究外源CTLA4Ig基因导入真核细胞的多个指标.进而用该表达载体转染活体大鼠,用荧光免疫方法检测该载体在大鼠体内各脏器的分布,通过斑点ELISA检测血清CTLA4Ig表达,通过组织形态学了解该载体是否对机体组织产生损害,通过基因转染大鼠异体皮肤移植模型,研究该基因在大鼠体内的表达及对同种异体皮肤的移植排斥反应的抑制作用.主要结果和结论如下:1.原位杂交显示,转染1h、12h后293细胞中CTLA4Ig mRNA表达率分别为10﹪和80﹪;免疫组化显示,用滴度为7×10<8> pfu/ml腺病毒转染液转染12h、24h的293细胞阳性表达率分别为71.2﹪、85﹪,二者之间差别有显著性意义(P<0.05).腺病毒转染后293细胞出现变圆、漂浮,说明该载体转染293细胞后产生大量的缺陷型腺病毒,并最终引起了293细胞死亡.2.免疫组化显示该腺病毒转染Hela细胞2h、4h、6h、8h均未见明显阳性细胞表达,而转染12h、24h、36h、60h阳性表达率呈增加趋势,12h、24h、36h之间比较差别有显著性意义(P<0.05),36h和60h之间差别无显著性意义(P>0.05):转染人成纤维细胞后2h、4h、8h、12h未见明显阳性细胞,转染24h、36h、60h阳性表达率渐渐升高,相互比较差别均有显著性意义(P<0.05);转染人脐静脉内皮细胞2h、4h、6h后未见明显阳性表达细胞,而转染8h、12h、24h,36h、60h阳性表达率逐步升高,8h与12h、36h与60h差别无显著性意义(P>0.05),其余各组比较差别均有显著性意义(P<0.05).当病毒滴度为7×10<6> pfu/ml时,未发现转染阳性细胞,可知只有腺病毒达到足够滴度时才可能有足量的腺病毒载体进入到细胞内并且表达出能够检测到的CTLA4Ig,表明适当的腺病毒滴度对于提高转染率至关重要,这也是进行活体基因转染的一个十分重要的参考指标.3.采用点膜ELISA检测显示大鼠转染7×10<9> PFU腺病毒后3天血清中可检测到CTLA4Ig表达,7-10天时血清中阳性表达最强,20天时还可检测到弱阳性,转染3.5×10<7> PFU腺病毒后7天血清中可检测到CTLA4Ig弱阳性表达.可见CTLA4Ig在血浆中的表达与病毒液的用量有关,随着用量的增加血中表达会增多,表达的时间一般在20天左右.4.腺病毒荧光抗体标记实验检测转染10天大鼠中腺病毒分布情况显示,腺病毒在肝、脾、心、肺、肾组织均有明显分布,并各有特点.组织形态学检测腺病毒转染后的大鼠组织,发现主要脏器的实质细胞均未见严重损伤性改变,淋巴细胞浸润也很轻微.在实验期间未发现转染大鼠出现并发症及死亡.5.转染大鼠同种异体移植皮实验显示,转染组移植皮生存时间为8-21天,平均18天,而对照组只能存活7天,相互比较差别有非常显著性意义(P<0.01).提示CTLA4Ig腺病毒导入大鼠体内细胞后表达了足量的CTLA4Ig并与B7分子牢固结合阻断了CD28介导的共刺激信号,从而抑制体内的免疫排斥反应.上述结果提示重组腺病毒介导CTLA4Ig基因在治疗器官移植排斥反应中具有良好的应用前景.