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据世界卫生组织报告，2015年全球共有78.8万名患者死于肝癌。在2018年，肝癌已成为全球六大常见的癌症之一，同时也是死亡率排名第四的癌症。肝癌有多种类型，包括肝内胆管细胞癌、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)以及其他罕见类型，其中HCC占所有肝癌发生率的75%至85%。因此研究HCC发生发展的机制尤为重要。γ-分泌酶(γ-secretase)复合物是一种早老素(presenilin, PSEN)依赖的天冬氨酰蛋白酶，由四个核心亚基PSEN、presenilinenhancer-2(PEN-2)、anteriorpharynxdefective-1(APH-1)和呆蛋白(nicastrin, NCT)组成，参与多种I型跨膜蛋白的膜内切割，例如β-淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)、E-cadherin、CD44和Notch1。γ-secretase复合物对底物的切割参与了多种生理及病理学过程，包括肿瘤的发生发展过程。Notch1作为γ-secretase复合物的底物被切割后会产生相应的Notch胞内段(Notch intracellular domain, NICD)，NICD是Notch1信号传导所必需的分子，与肝癌的发生发展密切相关。作为I型跨膜蛋白，CD147在许多癌细胞中高表达并促进细胞迁移、侵袭和增殖。然而，CD147促进癌细胞增殖的机制有待深入研究。
本研究分为五部分：
第一部分：CD147促进肝细胞癌Notch1信号通路的激活
使用siRNA干扰技术，抑制肝癌细胞系SMMC-7721细胞和Huh-7细胞中CD147的表达。发现当CD147表达水平降低后，Notch1、NICD及其下游靶分子表达显著降低。使用二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine, DEN)诱导的肝细胞特异性敲除CD147小鼠肝肿瘤模型，利用免疫组织化学分析发现敲除CD147分子后，Notch1(P=0.0091)、NICD(P=0.0052)的水平降低。通过westernblot检测发现，过表达CD147细胞株的cyclinD1水平显著升高，其可被干涉Notch1而降低。本部分结果显示：在HCC中，CD147可以促进Notch1的表达及Notch1信号通路的激活。
第二部分：PSEN1/γ-secretase复合物切割CD147释放出CD147胞内段入核
免疫荧光染色观察到在肝癌细胞系中CD147与γ-secretase复合物的核心亚基PSEN1具有共定位。Westernblot检测，在肝癌细胞全蛋白裂解液中发现了CD147胞内段(CD147 intracellular domain, CD147ICD)的表达。使用不同浓度的γ-secretase复合物的抑制剂DAPT处理细胞后，CD147ICD的水平呈DAPT浓度依赖性减少。过表达或干涉PSEN1后，CD147ICD水平随之呈正相关变化。对CD147跨膜区的氨基酸残基进行点突变，westernblot检测发现当lysine231突变后，CD147ICD显著减少。通过提取细胞核蛋白发现在细胞核内可检测到CD147ICD表达，且其表达水平被DAPT抑制。将CD147ICD上的核定位序列(nuclear localization sequence, NLS)突变或删除后，westernblot分析发现CD147ICD的入核能力丧失。本部分结果显示：CD147在跨膜区lysine231处被PSEN1切割，释放其胞内段CD147ICD，并入核。
第三部分：CD147ICD直接调控Notch1表达并参与Notch1信号通路传导
通过westernblot实验证明当CD147ICD过表达后，肝癌细胞系中Notch1、NICD和cyclinD1的表达明显上调。qPCR检测CD147ICD过表达对Notch1下游的经典分子水平的影响，结果显示Hes1、Hes5和Sox9的mRNA水平显著上调。染色体免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)实验以及双荧光素酶报告基因实验证明，CD147ICD可以直接与Notch1启动子结合从而促进Notch1表达。CCK-8实验和流式细胞周期分析实验证实，CD147ICD的过表达促进了细胞的增殖。本部分结果显示：在肝细胞癌中，CD147ICD通过结合Notch1启动子以促进Notch1的表达和Notch1信号通路的激活。
第四部分：核内CD147ICD表达是人HCC预后不良的标志物
免疫组织化学分析102例人肝癌组织中CD147ICD及Notch1表达水平，通过表达水平中位数将样本分为CD147ICDHigh和CD147ICDLow两组。生存分析显示CD147ICDHigh组的患者存活率显著低于CD147ICDLow组(P=0.0013)。相关性分析发现在肝癌组织中，核内CD147ICD的表达阳性率与Notch1表达水平之间呈显著性正相关(r=0.4882,P＜0.0001)。对样本中核内CD147ICD阳性率与肿瘤分化程度进行卡方分析，显示二者存在负相关性(P=0.015)。采用单因素变量和多因素变量Cox回归模型评估各种因素对癌症特异性存活的预后影响，证明癌症特异性存活与核CD147ICD阳性率显著相关(95%CI:1.522–29.283;P=0.012)。本部分结果显示：核CD147ICD阳性率可以预测人肝细胞癌的不良预后。
第五部分：γ-secretase复合物抑制剂DAPT和抗CD147单抗HAb18联合用药抑制荷人HCC原位移植瘤的增殖
构建人HCC细胞系的原位移植肿瘤模型用以评估抗CD147抗体HAb18和γ-secretase复合物抑制剂DAPT的治疗效果。小鼠模型随机分为四组：对照组、抗体组、抑制剂组和联合治疗组。治疗结果显示与对照组相比，抗体组(P=0.0019)和抑制剂组(P=0.0001)的肿瘤体积明显减小，而联合治疗组的肿瘤体积比抗体组(P=0.007)和抑制剂组(P=0.0199)进一步减小。对移植瘤块切片后进行免疫组织化学分析，显示抗体组和抑制剂组的Ki-67及CD147ICD水平降低，在联合治疗组中这两者的水平更低于抗体组和抑制剂组。本部分结果显示：γ-secretase复合物抑制剂DAPT和HAb18的联合治疗比单一疗法具有更好的疗效。
本研究分为五部分：
第一部分：CD147促进肝细胞癌Notch1信号通路的激活
使用siRNA干扰技术，抑制肝癌细胞系SMMC-7721细胞和Huh-7细胞中CD147的表达。发现当CD147表达水平降低后，Notch1、NICD及其下游靶分子表达显著降低。使用二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine, DEN)诱导的肝细胞特异性敲除CD147小鼠肝肿瘤模型，利用免疫组织化学分析发现敲除CD147分子后，Notch1(P=0.0091)、NICD(P=0.0052)的水平降低。通过westernblot检测发现，过表达CD147细胞株的cyclinD1水平显著升高，其可被干涉Notch1而降低。本部分结果显示：在HCC中，CD147可以促进Notch1的表达及Notch1信号通路的激活。
第二部分：PSEN1/γ-secretase复合物切割CD147释放出CD147胞内段入核
免疫荧光染色观察到在肝癌细胞系中CD147与γ-secretase复合物的核心亚基PSEN1具有共定位。Westernblot检测，在肝癌细胞全蛋白裂解液中发现了CD147胞内段(CD147 intracellular domain, CD147ICD)的表达。使用不同浓度的γ-secretase复合物的抑制剂DAPT处理细胞后，CD147ICD的水平呈DAPT浓度依赖性减少。过表达或干涉PSEN1后，CD147ICD水平随之呈正相关变化。对CD147跨膜区的氨基酸残基进行点突变，westernblot检测发现当lysine231突变后，CD147ICD显著减少。通过提取细胞核蛋白发现在细胞核内可检测到CD147ICD表达，且其表达水平被DAPT抑制。将CD147ICD上的核定位序列(nuclear localization sequence, NLS)突变或删除后，westernblot分析发现CD147ICD的入核能力丧失。本部分结果显示：CD147在跨膜区lysine231处被PSEN1切割，释放其胞内段CD147ICD，并入核。
第三部分：CD147ICD直接调控Notch1表达并参与Notch1信号通路传导
通过westernblot实验证明当CD147ICD过表达后，肝癌细胞系中Notch1、NICD和cyclinD1的表达明显上调。qPCR检测CD147ICD过表达对Notch1下游的经典分子水平的影响，结果显示Hes1、Hes5和Sox9的mRNA水平显著上调。染色体免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)实验以及双荧光素酶报告基因实验证明，CD147ICD可以直接与Notch1启动子结合从而促进Notch1表达。CCK-8实验和流式细胞周期分析实验证实，CD147ICD的过表达促进了细胞的增殖。本部分结果显示：在肝细胞癌中，CD147ICD通过结合Notch1启动子以促进Notch1的表达和Notch1信号通路的激活。
第四部分：核内CD147ICD表达是人HCC预后不良的标志物
免疫组织化学分析102例人肝癌组织中CD147ICD及Notch1表达水平，通过表达水平中位数将样本分为CD147ICDHigh和CD147ICDLow两组。生存分析显示CD147ICDHigh组的患者存活率显著低于CD147ICDLow组(P=0.0013)。相关性分析发现在肝癌组织中，核内CD147ICD的表达阳性率与Notch1表达水平之间呈显著性正相关(r=0.4882,P＜0.0001)。对样本中核内CD147ICD阳性率与肿瘤分化程度进行卡方分析，显示二者存在负相关性(P=0.015)。采用单因素变量和多因素变量Cox回归模型评估各种因素对癌症特异性存活的预后影响，证明癌症特异性存活与核CD147ICD阳性率显著相关(95%CI:1.522–29.283;P=0.012)。本部分结果显示：核CD147ICD阳性率可以预测人肝细胞癌的不良预后。
第五部分：γ-secretase复合物抑制剂DAPT和抗CD147单抗HAb18联合用药抑制荷人HCC原位移植瘤的增殖
构建人HCC细胞系的原位移植肿瘤模型用以评估抗CD147抗体HAb18和γ-secretase复合物抑制剂DAPT的治疗效果。小鼠模型随机分为四组：对照组、抗体组、抑制剂组和联合治疗组。治疗结果显示与对照组相比，抗体组(P=0.0019)和抑制剂组(P=0.0001)的肿瘤体积明显减小，而联合治疗组的肿瘤体积比抗体组(P=0.007)和抑制剂组(P=0.0199)进一步减小。对移植瘤块切片后进行免疫组织化学分析，显示抗体组和抑制剂组的Ki-67及CD147ICD水平降低，在联合治疗组中这两者的水平更低于抗体组和抑制剂组。本部分结果显示：γ-secretase复合物抑制剂DAPT和HAb18的联合治疗比单一疗法具有更好的疗效。