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目的: 视觉输入是影响屈光发育的重要因素。视觉信号刺激首先需要通过视网膜的感知,神经节细胞作为最后信号整合和输出的神经元在形觉剥夺影响屈光发育的过程中可能发挥重要作用。不同类型的神经节细胞形态变化反映出其功能的改变。本实验旨在探究形觉剥夺过程中小鼠视网膜不同类型神经节细胞形态的变化,为进一步探讨神经节细胞在视觉输入异常所导致的疾病,比如近视和弱视中所发挥的作用提供理论基础。 方法: 一、形觉剥夺对小鼠屈光发育的影响。实验组共筛选了60只表达黄色荧光蛋白的转基因小鼠(B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)HJrs/J),从出生后第3周开始建立单眼形觉剥夺两周的近视模型。形觉剥夺前,后使用红外偏心摄影验光仪对眼屈光力进行测量,使用光学相干断层扫描技术对眼轴长度、前房深度、晶状体厚度、玻璃体腔深度进行测量。 二、形觉剥夺对小鼠视网膜神经节细胞数量的影响。使用Brn3a抗体特异性地标记视网膜神经节细胞,计数比较形觉剥夺组(N=11)和对照组(N=9)神经节细胞数量变化的差异性。 三、形觉剥夺对小鼠视网膜神经节细胞形态的影响。对视网膜进行组化染色后,通过Neurolucida软件对显色清晰的视网膜神经节细胞进行三维重构,再由Neuroexplorer进行定量分析。Neuroexplorer主要对神经节细胞胞体和树突进行定量分析,形态参数包括胞体的面积、树突覆盖范围、树突数目、长度、弯曲度、分级数和分支角度,以及同心圆分析后所获得的树突节段长度和树突节段数目。研究形觉剥夺组与对照组小鼠视网膜神经节细胞形态参数的差异。 结果: 一、形觉剥夺组较对照组眼向近视方向偏移(实验后对照组:右眼:+3.48±1.27D,左眼:+2.73±1.21D;屈光度为两组右眼减左眼的差值比较,单因素方差分析:P<0.05)。形觉剥夺眼较正常对照眼和对侧眼眼轴长度有延长(对照眼:2.69±0.01,剥夺眼:2.78±0.01,对侧眼:2.73±0.01,P<0.05,单因素方差分析)。 二、形觉剥夺使小鼠视网膜神经节细胞数量较对侧眼和对照组眼显著减少(视网膜的中心区:对照组304±14个;剥夺眼:280±15个;对侧眼:376±17个;单因素方差分析:P<0.05;视网膜的周边区:对照组256±11个;剥夺眼:240±10个;对侧眼:286±13个,P<0.05,单因素方差分析)。 三、按照Neuroexplorer进行定量分析软件里的21个形态学参数将169个重构的视网膜神经节细胞分为四种类型,即Type1、Type2、Type3、Type4。统计发现形觉剥夺组和对照组视网膜上重构出的各类神经节细胞所占总神经节细胞数的比例并无显著差异(单因素方差分析:P>0.05)。 四、形觉剥夺对四类神经节细胞的形态的影响各不相同。 1. Type1神经节细胞剥夺眼(N=22)的树突覆盖范围和树突节段表面积较对侧眼(N=17)仅有降低趋势,剥夺眼较对照眼(N=15)这两项有明显增加(P<0.05,单因素方差分析);做同心圆分析(Sholl analysis)后可以看到剥夺组眼较对照组眼在距离胞体40-150um的地方,树突节段长度(dendrites intersection lengths,DIL)和树突节段数目(dendrites intersection number,DIN)均有增加。2. Type2神经节细胞剥夺眼(N=17)的细胞体积和树突最大垂直拓展较对侧眼(N=20)有明显增加,剥夺眼较对照眼(N=11)间的差异没有统计学意义;同心圆分析剥夺眼在距离胞体110um以内的范围,树突节段数目和节段长度均有显著减少;在距离胞体110um以外的范围,DIN和DIL均有明显增加(P<0.05,单因素方差分析)。 3. Type3神经节细胞剥夺眼(N=13)的树突覆盖面积、树突总长度较对侧眼(N=9)有明显增加;同心圆分析剥夺眼在距离胞体110um以外的范围,DIN和DIL较对侧眼和对照眼(N=12)均有明显增加(P<0.05,单因素方差分析)。4. Type4神经节细胞剥夺眼树突总表面积、最大水平拓展较对侧眼升高;同心圆分析剥夺眼(N=8)较对照组(N=15)在距离胞体180um以内的范围,DIN和DIL均有显著减少(P<0.05,单因素方差分析)。 结论: 视网膜作为近视研究的初级靶点一直备受关注。本研究发现形觉剥夺眼较正常对照眼和对侧眼眼轴长度有延长。形觉剥夺性近视小鼠视网膜神经节细胞的数量较对照组相比有明显减少,提示在形觉剥夺引起的视觉输入的减少影响了神经节细胞的生存,神经节细胞的减少可能构成了近视的发生和发展的基本细胞机制。