【摘 要】
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细胞分裂素（CTKs）广泛分布于植物体内且具有特殊的生物学功能,由于其浓度极低,准确检测CTKs的难度较大。本文通过表达了水稻细胞分裂素氧化酶,采用荧光光谱法研究了CKX与CTKs的
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细胞分裂素（CTKs）广泛分布于植物体内且具有特殊的生物学功能,由于其浓度极低,准确检测CTKs的难度较大。本文通过表达了水稻细胞分裂素氧化酶,采用荧光光谱法研究了CKX与CTKs的相互作用,获得了它们体外相互作用的热力学参数,并建立了异戊烯腺嘌呤的荧光检测方法。本文研究分为三个部分:1.采用NCBI检索了水稻细胞分裂素氧化酶的氨基酸序列,生物信息学分析该蛋白为可溶性蛋白,分子量约为58 kDa,等电点为6.19,通过同源建模的方法构建了天然状态下水稻细胞分裂素氧化酶的三级结构模型,采用PROCHECK评估该模型有良好的可靠性。2.通过提取日本晴RNA,采用RT-PCR扩增获得CKX基因,构建对应的重组体pET28a-CKX,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,通过优化表达条件,最终确立1 mM IPTG、5μg/L核黄素、15℃诱导8 h为最佳表达条件,实现了水稻CKX原核表达。并使用SDS-PAGE及Western-blot对表达蛋白进行了鉴定和分析。3.采用荧光光谱法研究了CKX和N6-异戊烯基腺嘌呤的相互作用。研究表明:N6-异戊烯基腺嘌呤通过一种静态猝灭方式猝灭细胞分裂素氧化酶的荧光信号。计算CKX和N6-异戊烯基腺嘌呤互相作用的结合常数与结合位点数,通过热力学常数?H、?G及?S的计算,推断二者结合时的作用力为范德华力或氢键。通过同步荧光光谱分析说明N6-异戊烯基腺嘌呤与CKX的互相作用位点都接近色氨酸残基和酪氨酸残基。不断加入N6-异戊烯基腺嘌,CKX辅基FAD的荧光强度不断地下降,建立了N6-异戊烯腺嘌呤的荧光检测方法。线性范围0.6μM-100μM,回归方程ΔF=0.04+0.15CiP（r=0.999,CiPμM）,检测限0.15μM。
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