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猪大肠杆菌病是集约化养猪中常见的细菌性传染病，由致病性大肠杆菌引起，主要表现为：七日龄以内的仔猪黄痢、出生一周到断奶的仔猪白痢以及断奶前后的仔猪水肿病，其中仔猪黄痢、白痢的发病率和死亡率都较高。在仔猪育肥阶段，大肠杆菌性腹泻使仔猪胃肠功能紊乱，饲料转化率下降，严重影响其生长发育，给养殖业造成很大的经济损失。恩诺沙星属于第三代氟喹诺酮药物，作为畜禽专用抗菌药已广泛应用于各种动物呼吸道和消化道细菌感染性疾病的预防和治疗。随着恩诺沙星在兽医临床和畜牧业中的普遍使用，造成大肠杆菌对其耐药的菌株也迅速增多。本试验通过构造猪回肠瘘管模型，直接考察恩诺沙星在猪回肠中的代谢动力学，同时研究恩诺沙星对大肠杆菌的体外和半体内药效学，将药动与药效学数据结合建立半体内PK-PD模型，制定恩诺沙星治疗猪大肠杆菌病的防耐药给药方案，减少耐药大肠杆菌的产生，为恩诺沙星在临床上的合理应用提供理论依据。 1.恩诺沙星在猪血浆和回肠中的药动学研究 试验选用12头体重20 kg左右的断奶仔猪，在回肠段安装T型瘘管，建立仔猪肠瘘模型，然后随机分为2组，实验组和对照组各6头。对实验组攻毒大肠杆菌(O101:K99)，建立猪感染大肠杆菌瘘管模型。两组动物均按2.5mg/kg体重单次肌肉注射恩诺沙星。给药后不同时间点取血液5mL和回肠内容物3~4mL，用高效液相色谱法检测血浆和回肠内容物中的恩诺沙星浓度，结果表明：与回肠内容物中恩诺沙星的浓度相比，血浆中恩诺沙星浓度较低，且不能直接反映患病处恩诺沙星与大肠杆菌的相互作用关系，不适合用于建立半体内PK-PD模型。健康猪各时间点回肠内容物中恩诺沙星的平均浓度分别为0、0.74、1.04、2.62、4.78、7.25、7.98、6.40、5.61、4.63、2.43、1.39μg/mL，患病猪各时间点回肠内容物中恩诺沙星的平均浓度分别为0.76、2.41、3.68、4.92、7.63、8.11、7.22、5.91、4.93、1.94、1.31μg/mL。健康猪和患病猪回肠内恩诺沙星浓度都较高，满足模型要求。 通过 Winnonlin软件拟合不同时间点回肠内容物中恩诺沙星的浓度数据，结果表明，经单次肌肉注射给药后恩诺沙星在健康猪和患病猪肠道内代谢过程均符合一室有吸收模型。恩诺沙星在猪肠道内达峰浓度Cmax为7.07~7.69μg/mL；达峰时间Tmax为5.18~5.54 h；T1/2ka为1.96~2.05 h，T1/2ke为7.66~8.5 h；曲线下面积AUC24h为135.64~136.18 h·μg/mL。 2.恩诺沙星对大肠杆菌(O101:K99)的药效学研究 参考临床实验室标准化研究所(CLSI)制定的相关标准文件，采用微量稀释法测定恩诺沙星及主要代谢物环丙沙星在肉汤和回肠内容物中对大肠杆菌(O101:K99)的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果表明，恩诺沙星在有氧条件下对大肠杆菌(O101:K99)具有较强的抗菌活性，恩诺沙星在肉汤和回肠内容物中对大肠杆菌(O101:K99)的最小抑菌浓度(MIC)分别为0.25μg/mL和0.5μg/mL，最小杀菌浓度(MBC)均为2μg/mL。环丙沙星在肉汤和猪回肠内容物中对大肠杆菌(O101:K99)的最小抑菌浓度(MIC)均为0.125μg/mL，最小杀菌浓度(MBC)均为0.25μg/mL。与恩诺沙星相比，环丙沙星对大肠杆菌(O101:K99)具有更强的抗菌活性。通过平板法测得恩诺沙星对大肠杆菌(O101:K99)的防突变浓度(MPC)为7.2μg/mL，耐药选择突变窗(MSW)为0.25~7.2μg/mL。环丙沙星对大肠杆菌(O101:K99)的防突变浓度(MPC)为0.9μg/mL，耐药选择突变窗(MSW)为0.125~0.9μg/mL。运用棋盘法测定恩诺沙星与环丙沙星的联合药敏指数 FIC为1，表明恩诺沙星和环丙沙星的杀菌作用呈现为相加作用。将猪大肠杆菌(O101:K99)分别暴露在不同浓度的恩诺沙星、环丙沙星溶液中1 h和2 h后测定抗菌后效应(PAE)的长短，结果表明猪大肠杆菌(O101:K99)与2MIC和4MIC浓度恩诺沙星接触1 h的PAE分别为0.57 h和1.23 h，接触2 h的PAE分别为0.77 h和1.43 h；猪大肠杆菌(O101:K99)与2MIC和4MIC浓度环丙沙星接触1 h的PAE分别为0.83 h和1.42 h，接触2 h的PAE分别为1 h和1.5 h。 根据MIC结果，配制不同浓度系列的恩诺沙星和环丙沙星溶液对大肠杆菌(O101:K99)绘制体外杀菌曲线。结果表明，随着恩诺沙星的浓度增加，杀菌时间变短，在2MIC以上，4 h以后达到完全杀菌效果。在恩诺沙星浓度为1MIC与2MIC时，18 h以后大肠杆菌恢复生长。与恩诺沙星相比，环丙沙星杀菌效果强于恩诺沙星。环丙沙星浓度为1MIC时，在6 h以后达到完全杀菌效果。 将不同时间点采集的猪回肠内容物，经离心过滤除菌后，与大肠杆菌(O101:K99)混合在37℃温箱中培养，绘制半体杀菌曲线。结果表明，恩诺沙星在健康猪回肠内容物和患病猪回肠内容物中对大肠杆菌(O101:K99)杀菌特点相似，都表现出明显的浓度依赖性。健康猪回肠内容物中0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h样品中恩诺沙星具有较强的杀菌活性，0.25、48 h样品中有抑菌活性；患病猪的杀菌能力与健康猪样品相似。结合恩诺沙星对大肠杆菌(O101:K99)的体外和半体内杀菌特征，确定描述恩诺沙星杀菌作用特点的PK-PD参数为AUC/MIC。 3.半体内PK-PD模型拟合与防耐药给药方案制定 体外和半体内杀菌曲线确定了描述恩诺沙星杀菌作用特点的PK-PD参数为半体内AUC/MIC。通过Sigmoid Emax方程模拟半体内AUC/MIC值与大肠杆菌数目减少之间的关系，患病猪的半体内PK-PD方程为：1.861.861.8634.177.572.23CCE+??=，当E=0、-3、-4(抑菌、杀菌、根除)时，对应的C值，即半体内AUC/MIC(h)值分别为21.37、52.65、78.06。结合给药方程(targetin vivo testedex vivo//MICAUC MICAUC DO=DE×)与临床分离目标菌株的MIC值，可得不同条件下的给药剂量DO(mg/kg/d)。当临床分离大肠杆菌的MIC50为2μg/mL，AUC/MIC(h)值分别为21.37、52.65、78.06时，对应恩诺沙星的给药剂量为0.78、1.95、2.8 mg/kg/d(抑菌、杀菌、根除)。 本试验体外杀菌曲线和半体杀菌曲线的结果表明，在4 h以后，高于2MIC浓度的恩诺沙星达到完全杀菌作用，但在12 h~18 h后，2MIC浓度以下的大肠杆菌部分恢复生长，结合AUC/MPC(18~19h)、T>MIC(30h)和T>MBC(14h)，若缩短给药间隔，采用每天给药两次，24 h内恩诺沙星的浓度均高于2MIC，理论上不会产生耐药大肠杆菌。同时根据耐药风险评估的结果，也不推荐每天一次给药，按治疗剂量每天给药两次可避免耐药大肠杆菌的产生。因此，对于猪大肠杆菌病的预防给药方案为0.78 mg/kg体重肌肉注射给药，每天给药两次；治疗给药方案为1.95 mg/kg体重肌肉注射给药，每天给药两次；根除方案为2.8 mg/kg体重肌肉注射给药，每天给药两次。 4.模型验证 选用MIC值为2μg/mL的临床分离大肠杆菌对仔猪进行攻毒，根据制定的防耐药给药方案：1.95 mg/kg每天两次注射给药治疗。结果表明该给药方案对发病的仔猪保护率达到83%且减少了耐药大肠杆菌的产生。 综上所述，本课题阐明了恩诺沙星对大肠杆菌的抗菌作用特点，揭示了恩诺沙星在健康猪和患病猪体内的药动学特征，通过建立肠道瘘管模型进行半体内PK-PD模型的研究，确定了恩诺沙星治疗猪感染大肠杆菌的给药剂量，并预测了耐药大肠杆菌的生长情况，为临床合理使用恩诺沙星提供了科学依据。