论文部分内容阅读
目的:基于中医学理论，采用现代细胞学与分子生物学技术与方法，通过体内外实验探讨三黄（黄芩、黄连、黄柏）有效成分抗湿热痹的药理学研究，比较三者之间的药理学差异。 方法:1.体外实验:体外培养类风湿关节成纤维样滑膜细胞（HFLS-RA），用含10％胎牛血清、1％双抗的完全培养基在37℃，5％CO2的培养箱中培养。分为空白组(K组)、模型组（M组）、黄芩苷组(Baicalin)[高（G组）、中（Z组）、低（D组）剂量组];黄连素组(Berberine，Ber)[高（G1组）、中（Z1组）、低（D1组）剂量组];黄柏碱组(Phellodendrine，Phe)[高（G2组）、中（Z2组）、低（D2组）剂量组]。采用MTT比色法检测三黄有效成分对TNF-α诱导HFLS-RA增殖的抑制作用;ELISA法定量检测HFLS-RA上清液中TNF-α和IL-17的水平;流式细胞仪检测HFLS-RA的凋亡率。 2.体内实验:选健康雄性Wistar大鼠60只，随机分成正常对照组（K组）、模型组（M组）、青藤碱阳性对照组（Y组）、Phe高剂量组（G组）、Phe中剂量组(Z组)、Phe低剂量组（D组）六组，采用注射弗氏完全佐剂方法制备大鼠RA模型。造模同时给药，青藤碱阳性对照组按60mg/kg体重给予灌胃，Phe低、中、高三个剂量组按照25mg/kg，50mg/kg，100mg/kg分别给予Phe灌胃，模型组和空白对照组给予同等体积的生理盐水灌胃，每天给药1次，给药结束后处死大鼠，取滑膜组织，蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测NF-κB p65和IκBα蛋白的表达，ELISA检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β及VEGF水平，观察大鼠足跖肿胀程度及关节炎指数评分。 结果:1.体外实验结果:(1)MTT比色法检测Baicalin、Ber、Phe对TNF-α诱导HFLS-RA增殖的抑制作用结果显示:与空白组比较，模型组均能够明显促进HFLS-RA的增殖(P＜0.05)，与模型组比较，Baicalin组没有对HFLS-RA增殖抑制，无统计学意义;Ber、Phe两组药物组对TNF-α诱导的HFLS-RA增殖具有抑制作用（P＜0.05），Phe药物组作用最为明显。 (2) ELISA定量检测HFLS-RA上清液中TNF-α和IL-17的水平:与空白组比较，模型组TNF-α和IL-17的含量明显升高(P＜0.05)，Baicalin组与模型组比较细胞因子含量无明显下降，无统计学意义;Ber、Phe两组药物组与模型组比较，细胞上清液中TNF-α和IL-17的含量显著下降(P＜0.05)，Phe药物组作用最为明显。 (3)流式细胞仪检测HFLS-RA凋亡率:与空白组比较，模型组凋亡率明显降低（P＜0.05），与模型组比较，Baicalin、Ber、Phe药物组凋亡率显著升高(P＜0.05)，Phe组尤为明显。 2.体内实验结果:(1) Western Blot法检测各组大鼠滑膜组织中NF-κB p65和IκBα蛋白的表达:与空白组比较，模型组中NF-κB p65和IκBα表达量明显增加(P＜0.05)，与模型组相比较，青藤碱和Phe组中的NF-κB p65和IκBα蛋白表达量显著减少（P＜0.05），Phe高剂量组尤为明显。 (2) ELISA检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β及VEGF水平:与空白组比较，模型组水平均增加(P＜0.05)，与模型组比较，Phe高、中、低剂量组均有显著降低，高剂量组最明显（P＜0.01）。足跖肿胀程度及关节指数(AI)评分在造模前无变化，造模后一段时间内有明显上升，经药物干预后，有显著下降(P＜0.05)。 结论: Ber、Phe通过抑制TNF-α诱导的HFLS-RA增殖，降低TNF-α和IL-17的含量;结果表明，三种药物有效成分均能促进HFLS-RA凋亡，以Phe作用最为显著。Phe可明显降低NF-κB信号通路中NF-κB p65和IκBα的蛋白表达，抑制细胞的活化生长通过抑制NF-κB信号通路。 黄柏的功效为清下焦湿热，泻肾火，可以改善湿热痹症，黄柏碱的药理作用能够抗炎解热，通过体外实验简要证实了黄柏碱的药理学作用能够对治疗RA起到十分重要的作用。黄柏的中药功效以及黄柏碱的药理学作用，采用现代实验方法，在临床上对该药应用于RA的治疗提供了药理学的研究基础。