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阿维菌素是由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)产生的一类十六元大环内酯类抗生素,是迄今已发现的最有效的杀昆虫剂、杀螨虫剂和杀寄生虫剂之一。本论文针对阿维菌素发酵过程阿维链霉菌易成球的特性研究了发酵初始条件和过程控制对菌丝形态的影响及其与阿维菌素合成之间的相关性；为了进一步从分子水平阐述阿维菌素发酵过程与阿维菌素合成相关变化,针对S.avermitilis细胞,尤其是从工业生产用复合培养基中收集得到的细胞杂质含量高、胞内代谢物复杂和蛋白酶活高等特点,对其蛋白质提取方法及双向电泳条件进行了系统研究,建立了完善的阿维链霉菌蛋白质组学分析方法,并从蛋白质水平讨论了阿维菌素发酵过程代谢及其调控变化。
50L全自动发酵罐阿维菌素发酵过程中,S.avermitilis的菌丝形态受到基础培养基氮源种类和碳源浓度、发酵罐接种量及溶解氧浓度的影响,菌丝形态从丝状生长到接近球状生长直至呈光滑紧密球状生长。借助菌丝形态分析软件,对菌丝球的面积和密度进行了定量计算。实验发现,添加速效氮源(如酵母膏)使得菌体生长过快,菌丝体成网状生长而不能结球,而添加酵母粉时,菌丝体趋于小球状生长。基础培养基碳源浓度(淀粉)从13％降至11％时,菌丝体由松散小球状生长变为紧密光滑球状生长。呈紧密光滑球状生长时,菌丝球的面积和密度受发酵罐接种量和前期溶氧的影响,低接种量(4.3％)批次发酵中后期平均外围菌丝密度为0.98左右,高接种量(8.6％)批次发酵中后期平均外围菌丝密度为0.78;非溶氧限制批次发酵中后期外围菌丝密度为0.98,而溶氧限制批次外围菌丝球密度降为0.8左右。整个发酵周期内阿维菌素产率与菌丝结球密度呈正相关,平均结球密度在0.95以上的批次阿维菌素产率在12.5 μg·mL-1·h-1以上。通过2T罐和150T。罐阿维菌素发酵过程补糖实验发现,中后期补加葡萄糖可维持菌丝球面积和密度在一定水平,延缓菌体自溶,这明显有助于发酵后期将阿维菌素合成速率维持在较高水平。
针对基于复合培养基的阿维菌素发酵样品杂质含量多、胞内蛋白酶活高的特点,对蛋白提取方法和二维电泳条件进行了系统优化。对于S.avermitilis而言,常用的破碎方法中蛋白得率依次为：珠磨法>超声裂解法>高压破碎法>液氮研磨法>冻融法>裂解液法；而样本容量以液氮研磨法和超声裂解法较为适中；从二维电泳(2-D)效果来看,液氮研磨法最好。除盐方法中,变性法即三氯乙酸/丙酮沉淀法能够有效去除细胞裂解液中盐离子以及其它高分子杂质,其效果明显优于Sephadex G50凝胶分子筛法、超滤法等非变性方法。使用再水化液重新溶解蛋白沉淀时,含有8M尿素的再水化液I优于含有7M尿素和2M硫脲的再水化液II,硫脲的使用虽然能够增强蛋白样品的溶解度,却造成2-D凝胶图谱酸性端严重的横条纹。针对S.avermitilis特有的蛋白酶种类,选择了EDTA、PMSF、Bestatin和Pepstatin四种蛋白酶抑制剂,以对胞内蛋白酶活的抑制率为考察指标,采用正交实验设计优化了蛋白酶抑制剂组合,各抑制剂在提取液中的终浓度为EDTA 4mM、PMSF 6mM、Bestatin 20μM和Pepstatin 30μM时对胞内蛋白酶活抑制力最强。另外,在环境温度从0-40℃升高的过程中,胞内蛋白酶活性增加约4-5倍。低温操作与优化的复合蛋白酶抑制剂的使用相结合有效地减少了提取过程中蛋白的降解,最终在采用相同上样量时,发酵中后期(110h)细胞蛋白提取样品单根胶条(pH4-7)2-DE图谱蛋白点检出数目增加了约20-30倍。采取优化的细胞全蛋白提取方法和双向电泳条件,得到了S. avermitilis的细胞全蛋白图谱。该方法所得到的双向电泳图谱点的聚焦效果好,单根胶条考染时点的检出数目为1200-1800(随上样量和培养体系变化而变化)。重复实验得到的不同凝胶上同一蛋白点的点密度值平均相对偏差小于30％,远低于判断蛋白上调/下调的偏差100％的标准。
运用质谱鉴定和差异蛋白质分析方法,研究了S.avermitilis模式菌株和工业菌株以及工业菌株在不同培养基中阿维菌素发酵过程蛋白表达的差异,共鉴定出了涉及碳代谢、氮代谢、能量代谢、次级代谢等代谢途径和代谢网络的132种差异蛋白质。分类分析表明,与工业菌株在TSB培养基中培养相比,阿维链霉菌在工业级复合培养基中培养52h,阿维菌素合成随着菌体比生长速率的降低而启动,代谢发生明显变化,此时TCA途径酶表达量明显降低,能量代谢相关酶水平降低,暗示代谢流向次级代谢转移。而参与碳水化合物运输和代谢途径的酶以及糖酵解途径酶表达量较高,证实了葡萄糖代谢在阿维菌素合成过程中所处的核心地位。复合培养集中氨基酸代谢途径相关酶的低表达说明充足的碳源使得氨基酸异化途径减弱,而谷氨酰胺合成酶(GS)在复合培养基中的高表达与此时较低的NH4+浓度有关。同时,由于次级代谢物阿维菌素合成的启动,表现出较高的协迫蛋白表达,包括GroEL、DnaK、GrpE等。这些蛋白参与细胞信号转导、蛋白质折叠等过程,体现细胞在环境胁迫条件下的主要自我保护机制。大量抗碲蛋白的高表达也与这种胁迫条件有关。醇脱氢酶在阿维菌素合成启动时出现的高表达推测是对数生长末期葡萄糖限制的诱导结果,该类酶不但在维持胞内NAD(P)H/NAD(P)+平衡中起重要作用,而且通过此类酶可将醇类代谢副产物引入中心代谢途径,以维持细胞的生长和代谢。由axe编码的乙酰木聚糖酯酶、由aveBVII编码的dTDP-6-脱氧-L-己糖-3-氧-甲基转移酶、由aveD编码的甲基转移酶和aveG编码的硫酯酶可能是调控阿维菌素合成途径的关键酶。从差异蛋白组分析来看,一些可能的调控蛋白包括脱氢酶SAV_4755/2735、反σ因子拮抗蛋白RsbV、核苷酸结合蛋白、IclR家族转录调节子、Clp蛋白、PPIases、孢子形成调控蛋白SsgA在阿维菌素组分之间的转换、饥饿和胁迫条件下的转录调节、阿维菌素合成的启动以及菌丝形态分化等方面起着重要的调节作用,是进一步用代谢工程的手段对阿维链霉菌工业菌株进行改造的关键点。与模式菌株相比,工业菌株碳代谢和氮代谢相关蛋白表达显著增强,而能量代谢相关蛋白表达减弱,对环境胁迫的响应也变得更灵敏。同时,有相当数量的未知蛋白在工业菌株中的高表达,可能与次级代谢物合成和调节有关,其具体功能还有待进一步研究。