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研究背景:骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种慢性退行性疾病,是老年人疼痛、功能丧失和残疾的主要原因,严重影响患者的生活质量。膝关节是OA中最常见的受累关节。目前临床上针对膝骨关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)尚无特异性的治疗方法,一般是对症处理、缓解疼痛,然而非甾体类抗炎镇痛药可能会引起上消化道出血等不良反应。随着病情进展,KOA患者可能需要进行单髁置换术、膝关节置换术,但对于年龄较大的患者,手术风险率大大升高。KOA的发病受诸多因素影响,如性别、衰老。研究发现,绝经后女性KOA患病率显著增加,明显高于男性。传统观念认为雌激素水平下降是绝经后KOA患病率增高的主要原因,人软骨细胞的胞浆和胞核中存在雌激素受体,育龄期女性体内雌激素与受体结合后,可促使软骨细胞的分化和增殖,故临床上众多绝经后女性因体内雌激素水平下降,膝关节软骨发生退行性改变。动物体内实验发现,去卵巢大鼠予以雌激素补充治疗,结果显示Ⅱ型胶原降解被显著抑制,且大鼠膝关节软骨表面的完整性得以很好地保护。但是也有报道发现,在仅有卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)升高而雌激素未明显降低的围绝经期,KOA发病率就已经明显增加,提示FSH有可能直接影响KOA的发生。FSH是由垂体分泌,其与卵巢分泌的雌激素在体内存在反馈-负反馈调节,绝经后女性雌激素水平下降,但FSH水平显著升高,故将FSH的升高作为绝经期开始的标志。国内学者曾发现,相比于其它年龄阶段,50-60岁年龄组的绝经后女性FSH水平最高,大约从60岁之后又随年龄增长而下降。研究发现FSH可以独立于雌激素之外,直接调节骨代谢。FSH可直接作用于Gi2α偶联的FSH受体(FSH receptor,FSHR)来刺激破骨细胞的形成,相关机制涉及到AKT/NF-κB信号通路的激活,从而促进骨吸收。动物体内实验也发现,去卵巢大鼠予以FSH注射处理之后,牙槽骨丢失也明显增加,更能明确FSH可独立于雌激素之外对骨量产生影响。骨质疏松症(osteoporosis,OP)与OA是密切相关的两种疾病,当软骨下骨发生OP时,会出现关节不稳或不稳定区域的保护性增生,促进OA的发生发展。然而,FSH是否独立于雌激素之外,对绝经后女性KOA患者的软骨直接造成影响,国内外未见报道。本实验室前期研究已经证实,在人软骨细胞膜上有FSHR蛋白的表达。既然在50-60岁年龄段FSH分泌水平呈高峰时期,50-60岁绝经后女性KOA患病率增长迅速,所以我们推测FSH与软骨细胞膜上FSHR结合,进而对50-60岁年龄段绝经后女性KOA患者的软骨造成不利影响,故本课题拟从这一角度予以探讨。针对这一假设,我们将分别从临床实验与细胞实验出发,希望有助于深入研究绝经后女性KOA的发病机制。PI3K/AKT信号通路在机体内作用广泛,参与许多生理病理的进程,其中,其与OA关节软骨的退化和破坏亦密切相关,因此通过作用于PI3K/AKT信号通路来减轻OA病情被视为可行的策略,已有相关研究发现,PI3K/AKT/mTOR通路可以影响骨关节炎大鼠关节软骨细胞的自噬,从而参与炎症反应。给予大蒜素可以抑制PI3K/AKT/NF-κB通路,延缓OA进程。川皮苷是一种黄酮类化合物,在白介素-1β(interleukin-1β、IL-1β)诱导的人软骨细胞和内侧半月板损伤手术小鼠OA模型中,其可以通过抑制PI3K/AKT磷酸化活性以及NF-κB的激活,能有效地抑制炎症反应程度,进而产生了明显的软骨保护作用,上述研究从侧面说明了 PI3K/AKT通路可能是KOA发病的关键信号通路。本研究临床实验部分旨在观察不同FSH水平对50-60岁绝经后女性KOA患者主观症状和影像学改变所产生的影响,另外,我们也探讨了 FSH是否通过作用于PI3K/AKT/NF-κB信号通路进而促进绝经后女性KOA患者关节软骨的破坏。ATDC5细胞来源于小鼠胚胎瘤细胞株AT805,在适当刺激下,其可发生增殖、聚集并进入软骨细胞分化阶段,最终分化成增殖性软骨细胞。此外,ATDC5细胞还可合成细胞外基质(extracellular matrix,ECM)主要成分,比如聚集蛋白聚糖(aggrecan)、Ⅱ型胶原等,因此ATDC5是研究软骨细胞的可靠模型。PI3K/AKT通路在ATDC5软骨细胞代谢方面作用突出,譬如相关研究已经证实Laquinimod可以明显减轻IL-1β诱导的ATDC5软骨细胞中TNF-α和IL-6等促炎介质释放的增加,其还能通过抑制基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinases-3、MMP-3)、MMP-13的表达从而减轻Ⅱ型胶原的降解,又能通过抑制血小板反应蛋白基序4(thrombospondin motifs-4、ADAMTS-4)、ADAMTS-5 的表达从而减轻 aggrecan的降解,然而Laquinimod这些有益作用的实现均得益于其对PI3K/AKT/NF-κB通路的抑制作用。与之相反,非编码RNA LncHIFCAR可通过激活PI3K/AKT/mTOR通路促进ATDC5软骨细胞OA的加重。这一正一反的研究结果均提示我们PI3K/AKT通路在ATDC5软骨细胞中发挥着重要的作用。鉴于FSH对软骨损伤作用的具体机制,目前研究尚不明确,故本研究细胞实验部分基于ATDC5这一软骨细胞模型,首先重点观察FSH对ATDC5细胞ECM的影响,然后又验证了 FSH是否通过PI3K/AKT/NF-KB信号通路从而加剧了对ATDC5软骨细胞的破坏作用。目 的:1、明确不同FSH水平对50-60岁绝经后女性KOA患者临床症状程度、生化指标和影像学指标的影响。2、观察FSH是否可通过PI3K/AKT/NF-κB通路促进50-60岁绝经后女性KOA患者关节软骨破坏。3、体外观察FSH是否可通过PI3K/AKT/NF-κB通路加剧ATDC5软骨细胞ECM成分降解,明确FSH加重软骨损伤的分子机制。研究方法:1、选取临床上行膝关节置换术或膝关节单髁置换术或KOA保守治疗的50岁以上绝经后女性患者215例,按10岁为一个年龄段,分为三组,50-60岁有79人,61-70岁88人,>70岁48人。其中50-60岁年龄组,按照FSH高低分两组,高FSH 组(>40mIU/ml)45 人、低 FSH 组(<40mIU/ml)34 人。测量身高、体重,计算体重指数(BMI),进行WOMAC量表评分、X线拍片、膝关节磁共振T2-mapping成像。三组人群空腹抽血,检测卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。2、50-60岁年龄组,比较高FSH组和低FSH组血TC、LDL-C、FSH、E2以及WOMAC评分、T2值。对病理切片进行番红固绿染色。Western blot检测人软骨组织PI3K、AKT、NF-κB的磷酸化和总蛋白表达。3、ATDC5细胞在不同浓度FSH刺激下,免疫荧光染色检测NF-κB p65、collgan2A、aggrecan 表达,以及 Western blot 检测 PI3K、AKT、NF-κB、IκBα的磷酸化和总蛋白以及collgan2A的蛋白表达。结 果:1、50-60岁年龄段绝经后女性KOA患者FSH水平呈现分泌高峰绝经后女性KOA患者根据年龄分为50-60岁组、61-70岁组、>70岁组,三组间身高、体重、BMI、E2、FPG无显著性差异(P>0.05);三组间E2呈统一低下水平;50-60岁组TC、LDL-C均高于其他两组,与>70岁组相比,显著升高(P<0.05),其他组间比较无显著差异(P>0.05);与61-70岁组和>70岁组相比,50-60岁组FSH显著升高(P<0.05或P<0.001)。2、FSH加重绝经后女性KOA患者的磁共振软骨损伤和脂代谢紊乱50-60岁年龄组,按照FSH高低分两组,高FSH组和低FSH组,两组间BMI、E2无显著性差异(P>0.05)。高FSH组TC、T2mapping值与低FSH组相比,显著增高(P<0.05),LDL-C、WOMAC评分有增高,但无显著性差异(P>0.05)。3、FSH加重绝经后女性KOA患者的软骨病理损伤低FSH组KOA患者病理切片可见软骨表面浅裂隙,移行层可见软骨细胞簇积现象,移行层和辐射层交界处可见脱水固缩坏死的软骨细胞,形成缺损区,表面出现多个空隙窝,潮线较完整,细胞分布密度尚可。高FSH组KOA患者病理切片可见表面粗糙,出现多个裂隙,从软骨表面向下延伸至辐射层,裂隙中有软骨细胞簇积现象,软骨细胞数目较低FSH组明显减少,四层结构排列紊乱加重,不易分辨。我们重点观察到高FSH组KOA患者病理切片100×显微镜下可见以下几种病理改变:(1)潮线复制、漂移、间隙增宽,出现多条潮线,钙化层明显增厚;(2)钙化层增厚伴血管长入;(3)潮线断裂、缺失;(4)钙化层及深层软骨缺损,直接暴露软骨下骨。4、FSH显著激活绝经后女性KOA患者的PI3K/AKT/NF-KB信号通路Western blot检测到,与低FSH组相比,高FSH组p-PI3K、p-AKT、p-NFKB表达显著增强。高FSH组的p-PI3K/PI3K 比值、p-AKT/AKT 比值、p-NFκB/NFκB比值显著高于低FSH组(P<0.05或P<0.01)。5、FSH抑制ATDC5软骨细胞collgan2A和aggrecan表达,促进NF-κB p65入核ATDC5细胞分别给予FSH Ong/μl和90ng/μl浓度刺激。ATDC5细胞受FSH 90ng/μl浓度刺激后,通过免疫荧光染色观察到NF-κB p65细胞核移位显著增加,而collgan2A和aggrecan的表达被显著抑制。6、FSH显著激活ATDC5软骨细胞的PI3K/AKT/NF-κB信号通路Western blot 检测,ATDC5 细胞分别给予 FSH Ong/μl、9ng/μl、30ng/μl、90ng/μl四个浓度刺激,随着FSH浓度的增加,collgan2A、总IκBα表达逐渐减弱,p-PI3K、p-AKT、p-NFκB、p-IκBα表达逐渐增强;p-PI3K/PI3K 比值、p-AKT/AKT 比值、p-NFκB/NFκB比值、p-IκBα/IκBα 比值显著增加,并且呈一定的浓度依赖性(P<0.05,P<0.01,P<0.001 或 P<0.0001)。结论:1、FSH加重50-60岁年龄段绝经后女性KOA患者的主观症状和影像学损害,FSH可能通过激活PI3K/AKT/NF-κ信号通路,加重KOA患者的软骨损伤。2、FSH可激活ATDC5软骨细胞PI3K/AKT/NF-KB信号通路,促进NF-κB p65细胞核移位,并抑制collgan2A和aggrecan的表达,加重ECM成分的降解,提示FSH参与了软骨损伤。