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酯酶作为重要的工业酶,具有催化酯键水解、合成的能力,广泛应用于食品、医药、化工、军事等行业。本试验在产酯酶菌株HSM的筛选、菌种鉴定、发酵条件优化、诱导剂对产酶的影响、酯酶的分离纯化以及酶学特性等方面做了比较全面的研究。
首先采用三丁酸甘油酯平板透明圈法,从泸州老窖、枝江大曲等中温、高温及中高温大曲中,以筛选平板上水解透明圈出现的快慢和直径大小作为初筛依据,以发酵液酯酶活力为复筛依据,筛选得到了一株高产酯酶菌株HSM,平均酶活力达到5.38U/mL。通过菌种形态学鉴定及18S rDNA-ITS序列分析并结合系统发育分析,将HSM菌株鉴定为Lichtheimia(横梗霉属)。
通过单因素试验,首先优化了HSM菌产酯酶液态培养基的碳氮源,确定可溶性淀粉为最佳碳源,酵母浸粉与KNO3的浓度配比为3∶1时为最佳氮源。通过PB试验设计,得到3个对产酶结果影响最突出的因素是:MgSO4、KNO3和酵母浸粉。通过BBD试验设计对该三个显著因素进行进一步优化从而确定最优水平。得到优化后的最适培养基配方为:可溶性淀粉1.8%、酵母浸粉1.8%、KNO30.5%、K2HPO40.04%、MgSO40.04%、KCl0.04%、FeSO40.001%、MnSO40.04%。通过单因素优化得到HSM菌株发酵产酯酶的最适发酵条件为:发酵温度34℃、接种量10%、装液量45mL/200mL、发酵初始pH值6.5、转速180rpm。经过这些最佳参数的简单组合发酵,酶活力可以达到8.90U/mL,与初始条件相比增加了65.43%。
通过试验研究不同类型的诱导剂对HSM菌株产酯酶的影响,得出该酯酶为诱导型酶,己酸乙酯、橄榄油及吐温-80对产酯酶的诱导作用比较强烈,己酸乙酯的效果最佳,在0.2%的添加浓度下能使产酶量提高92.35%,发酵液的酶活达到15.58U/mL。
试验经40%和80%的硫酸铵饱和度两步沉淀法、透析脱盐以及PEG20000浓缩后,采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析技术,获得部分纯化酯酶。纯化后的酯酶比活力为6209.06U/mg,酶活性回收率为2.17%,纯化倍数达到26.79。
酯酶反应的最佳温度为50℃,对高温比较敏感;最适作用pH值为7.4,pH值作用范围(7.2~7.8)比较窄,但有较好的耐碱性。酯酶最适反应盐度为8%(W/V)的NaCl浓度,NaCl浓度达到12%时,酶活性仍保持在60%以上,说明具有较高的耐盐性。Mg2+、Ca2+对酶活性的影响不明显,而Mn2+、Zn2+、Cu2+则表现出不同程度的抑制作用,其中Cu2+具有最显著的抑制作用。
首先采用三丁酸甘油酯平板透明圈法,从泸州老窖、枝江大曲等中温、高温及中高温大曲中,以筛选平板上水解透明圈出现的快慢和直径大小作为初筛依据,以发酵液酯酶活力为复筛依据,筛选得到了一株高产酯酶菌株HSM,平均酶活力达到5.38U/mL。通过菌种形态学鉴定及18S rDNA-ITS序列分析并结合系统发育分析,将HSM菌株鉴定为Lichtheimia(横梗霉属)。
通过单因素试验,首先优化了HSM菌产酯酶液态培养基的碳氮源,确定可溶性淀粉为最佳碳源,酵母浸粉与KNO3的浓度配比为3∶1时为最佳氮源。通过PB试验设计,得到3个对产酶结果影响最突出的因素是:MgSO4、KNO3和酵母浸粉。通过BBD试验设计对该三个显著因素进行进一步优化从而确定最优水平。得到优化后的最适培养基配方为:可溶性淀粉1.8%、酵母浸粉1.8%、KNO30.5%、K2HPO40.04%、MgSO40.04%、KCl0.04%、FeSO40.001%、MnSO40.04%。通过单因素优化得到HSM菌株发酵产酯酶的最适发酵条件为:发酵温度34℃、接种量10%、装液量45mL/200mL、发酵初始pH值6.5、转速180rpm。经过这些最佳参数的简单组合发酵,酶活力可以达到8.90U/mL,与初始条件相比增加了65.43%。
通过试验研究不同类型的诱导剂对HSM菌株产酯酶的影响,得出该酯酶为诱导型酶,己酸乙酯、橄榄油及吐温-80对产酯酶的诱导作用比较强烈,己酸乙酯的效果最佳,在0.2%的添加浓度下能使产酶量提高92.35%,发酵液的酶活达到15.58U/mL。
试验经40%和80%的硫酸铵饱和度两步沉淀法、透析脱盐以及PEG20000浓缩后,采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析技术,获得部分纯化酯酶。纯化后的酯酶比活力为6209.06U/mg,酶活性回收率为2.17%,纯化倍数达到26.79。
酯酶反应的最佳温度为50℃,对高温比较敏感;最适作用pH值为7.4,pH值作用范围(7.2~7.8)比较窄,但有较好的耐碱性。酯酶最适反应盐度为8%(W/V)的NaCl浓度,NaCl浓度达到12%时,酶活性仍保持在60%以上,说明具有较高的耐盐性。Mg2+、Ca2+对酶活性的影响不明显,而Mn2+、Zn2+、Cu2+则表现出不同程度的抑制作用,其中Cu2+具有最显著的抑制作用。