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各种因素诱导神经元的凋亡有多方面机制，包括兴奋毒性学说、离子紊乱学说、氧化应激学说和基因调节学说等。在凋亡产生机制的离子因素以往研究中，主要是对Ca2+、K+和Na+离子活动的关注，氯离子的活动多年来未引起重视。一氧化氮(NO)是一种重要的信号转导分子，参与脑内许多生理和病理过程。大量证据表明，缺血性脑损伤后脑内大量产生NO，过量的NO能对脑细胞产生神经损伤作用，能诱导神经细胞凋亡。本研究以培养12天的SD大鼠海马神经元为研究对象，模拟脑缺血的产生机制，利用NO供体SIN-1诱导离体海马神经元凋亡的模型，通过对细生存率、细胞的免疫荧光染色和凋亡细胞记数、Westernblot检测凋亡相关蛋白(caspase-3)和膜片钳全细胞记录氯通道电流等方法观察了氯通道在海马神经元凋亡中的作用，试图探讨氯通道在缺血性脑损伤中的作用。
一、SIN-1诱导离体海马神经元凋亡模型的建立
按培养神经元的方法，用Neurobasal培养基培养的正常12天的SD大鼠海马神经元，光学显微镜下观察显示：正常神经元胞体饱满、光滑，呈锥体形或卵圆形，突起交叉成网；对神经元进行硫堇染色，在膜内侧和胞核的边缘可以清晰的显示尼氏小体，进一步确定本实验常规培养的细胞为神经元；用DNA荧光试剂Hoechst33258和神经元特意性抗体抗-NeuN对神经元双染色，结果发现培养的细胞85.47±2.26％(n=3)以上都呈阳性。
结果还发现，SIN-1诱发海马神经元的损伤作用有明显的浓度依赖性，随着浓度的增加其诱导神经元的损伤作用也明显增加。在0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0mmol/L浓度的SIN-1细胞生存率分别为101.47±7.32％、87.43±3.58％、70.74±3.15％、68.90±1.7％、55.91±2.09％、42.89±2.45％和11.00±1.42％。结果显示，1.0mmol/L浓度的SIN-1可显著诱导神经元发生死亡；2.0mmol/L浓度的SIN-1可使90％左右的神经元发生死亡。
本实验发现，培养的正常神经元内的Caspase-3很少被激活，Westernblot检测结果可表现出32KD未激活肽段条带，裂解的活化肽段条带不明显；SIN-1处理后的神经元有大量Caspase-3活化的17KD和11KD裂解片段，氯通道阻断剂SITS、DIDS和NPPB能不同程度地减少caspase-3的激活，使17KD和11KD的条带减弱。
以上结果表明，利用本实验所用的细胞培养方法可得到85％以上的神经元，用1mmol/L的NO供体SIN-1可建立神经元凋亡的模型。
二、氯通道阻断剂(SITS，DIDS，NPPB)对SIN-1诱导神经元损伤的保护效应
为观察氯通道在SIN-1诱导离体海马神经元凋亡中的作用，本实验设计了正常对照组、SIN-1处理组、SIN-1+SITS、SIN-1+DIDS和SIN-1+NPPB组。实验时，氯通道阻断剂与SIN-1同时加在培养基中，作用18小时后测定细胞的生存率。结果显示：正常组细胞的生存率是100.17±3.37％；0、10、50、100、200、300μmol/LDIDS浓度组分别是61.68±4.18％、74.87±3.42％、73.18±3.15％、83.23±3.61％、77.12±2.39％、68.96±1.46％。与SIN-1(1mmol/L)组细胞生存率55.91±2.09％相比，10μmol/LDIDS有显著的抗凋亡作用，100μmol/L浓度DIDS组细胞的生存率高于其它浓度组；当浓度低于0.3mmol/L时SITS没有明显的抗损伤作用，0.5～2mmol/L的浓度有明显的抗SIN-1效应，0.5mmol/L组细胞的生存率可达到91.33±2.87％，与0mmol/LSITS组相比有显著差别(P＜0.05，n=6)。在0～2.0mmol/L之间浓度的NPPB未发现有明显的抗神经元损伤作用，与SIN-1组相比没有明显差别(P＞0.05，n=6)。
三、兴奋性氨基酸受体(NMDA/AMPA受体)阻断剂和广谱钙通道阻断剂(CdCl2)对SIN-1诱导培养海马神经元凋亡的影响
1.MK-801和CNQX对SIN-1诱导培养海马神经元损伤的影响为探讨SIN-1(1mmol/L)诱导海马神经元凋亡损伤的离子基础，观察兴奋性氨基酸受体是否参与SIN-1诱导的培养海马神经元凋亡，本实验设计了正常对照组、SIN-1组、SIN-1+MK-801、SIN-1+CNQX、SIN-1+SITS、SIN-1+DIDS组。MTT法测定细胞生存率结果如下：正常组细胞生存率是100.1±2.5％；SIN-1组63.68±2.23％，与正常组相比有显著差别(P＜0.05，n=6)。MK-801(10μmmol/L)和CNQX(5μmmol/L)组的细胞生存率分别是72.9±1.80％和64.78±1.69％，与SIN-1组相比均不能有效阻断SIN-1诱导神经元凋亡的效应。
结果提示，NMDA和AMPA受体不参与SIN-1诱导的培养海马神经元的凋亡，主要是氯通道参与了该凋亡过程。
2.广谱钙通道阻断剂(CdCl2)对氯通道阻断剂神经保护作用的影响
为探讨Ca2+离子内流是否参与SIN-1诱导培养海马神经元的凋亡，本实验把培养细胞分为正常对照组、SIN-1组、CdCl2、SIN-1+CdCl2、SIN-1+SITS+CdCl2、SIN-1+CdCl2+DIDS组。
以上结果表明，SIN-1诱导培养海马神经元的凋亡过程不依赖Ca2+内流，进一步说明可能主要是氯通道参与了SIN-1诱导的海马神经元凋亡过程。
四、CIC-2和CIC-3氯通道蛋白在培养海马神经元上的表达
为观察培养的海马神经元上是否有电压敏感性氯通道的表达，本实验用抗CIC-3和抗CIC-2抗体，确定两种离子通道在培养12天SD大鼠海马神经元上的表达情况。免疫荧光染色结果显示：在离体培养12天的海马神经元上有CIC-2和CIC-3的阳性表达。我们推测SIN-1产生的NO可能是激活这两种氯通道引起培养海马神经元的凋亡。
五、培养海马神经元氯通道全细胞电流的记录
为进一步证实氯通道在SIN-1诱导海马神经元凋亡中的作用，本实验利用全细胞记录模式，观察了在SIN-1处理前后、氯通道阻断剂使用前后氯通道全细胞电流密度的变化。
(一)正常培养海马神经元氯通道电流的记录及氯通道阻断剂的影响
本实验采用全细胞记录模式在高阻封接破膜5分钟后记录氯通道电流。结果显示，正常情况下氯通道电流随膜的逐渐去极化由负值向正值变化，电流密度从膜电压-100mV的-8.19±1.92pA/pF(n=6)升到膜电压+80mV的22.46±1.50pA/pF(n=6)，变化趋势呈外向整流特性。膜反转电位约为-70mV,大致接近氯离子的膜平衡电位；膜电流的变化呈电压依赖性，与时间依赖性关系不大，未发现有明显的Run-down现象。
结果提示，在培养的海马神经元上存在有外向整流氯通道，这种通道电流可能是由CIC-2和CIC-3氯通道共同激活的结果。
(二)SIN-1诱导培养海马神经元损伤后全细胞氯通道电流的变化
为进一步探讨氯通道在海马神经元缺氧缺血性损伤凋亡中的作用，本实验观察了用SIN-1处理前后培养海马神经元氯通道电流的变化。采用全细胞记录模式，高阻封接破膜稳定5分钟后记录正常通道电流。浴槽液中加SIN-1(终浓度为1mmol/L)作用10-15分钟后再记录通道电流的变化，并观察了氯通道阻断剂SITS和DIDS对通道电流的影响。
结果提示，NO供体SIN-1处理神经元后能明显增加氯通道的电流密度，这些电流的增加能几乎被氯通道阻断剂SITS、DIDS所阻断，进而证实氯通道参与了SIN-1诱导的培养海马神经元的凋亡。
总结本实验结果我们推测：在缺血性脑损伤中，脑内过量产生的NO可激活神经元上的氯通道，氯通道的活动增强参与了缺血性脑神经元的凋亡过程。
结论
1.SIN-1是一种NO供体，SIN-1诱导培养海马神经元的凋亡具有浓度依赖性；NMDA和AMPA受体阻断剂和广谱钙通道阻断剂CdCl2不影响SIN-1的作用；SIN-1引起的神经元损伤是一种不依赖Ca2+内流的神经元凋亡模型。
2.氯通道阻断剂SITS和DIDS能明显呈浓度依赖性地提高细胞生存率，抑制SIN-1诱导培养海马神经元凋亡的毒性作用；广谱钙通道阻断剂CdCl2不影响氯通道阻断剂的神经保护作用。
3.正常培养的海马神经元上有电压依赖性氯通道CIC-2/CIC-3的表达；离体培养的海马神经元氯通道全细胞电流呈电压依赖性，表现出外向整流特性；SIN-1能增加培养海马神经元氯通道的电流密度，这种电流密度的增加能被氯通通阻断剂SITS和DIDS所抑制。
4.电压依赖性氯通道CIC-2/CIC-3活动的增强可能参与了SIN-1诱导的培养海马神经元的凋亡。氯通道可能参与了缺血性脑损伤海马神经元的凋亡。
5.本研究为缺血性脑损伤的离子通道机制提供了新的定实验资料，为临床缺血性脑损伤的临床研究和治疗提供了理论上的参考依据。