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本研究采用体外培养大脑皮层神经元氧化应激模型,探讨PPARγ在氧化应激导致的神经元死亡中的保护作用以及HDAC4对其活性的调节机制。
我们首先建立了皮层神经元氧化应激模型。培养7天的神经元分成两组:对照组,不进行任何处理；H2O2组,加入终浓度为36μM的H2O2。处理24 h后进行DAPI细胞核染色,计算细胞死亡率。结果显示:对照组和H2O2组细胞死亡率分别为17.05±2.83％和55.35±4.51％,两组比较具有显著性统计学差异(P<0.01)。
我们应用PPARγ荧光素酶报告基因检测方法,检测了在氧化应激情况下PPARγ的转录活性。我们在培养第6天的神经元上用磷酸钙-DNA共沉淀法将PPARγ报告基因质粒PPREx3-TK-luc转染神经元,经过12h的表达后分为三组:对照组不做任何处理；H2O2组,提前30min加入终浓度为千分之一的DMSO,以终浓度为36μM的H2O2处理4h；TSA组,提前30min加入终浓度为1μM的HDAC的抑制剂TSA,以同样终浓度的H2O2处理4h。以对照组荧光素酶活性为100％进行统计,结果显示:PPARγ报告基因活性％三组分别为:100±0.06％、55.89±2.50％和91.05±7.20％。H2O2组与对照组差别有统计学意义(P<0.001)。氧化应激可以使PPARγ活性显著下降,而HDAC抑制剂TSA可以部分阻止这种下降(P<0.01),提示神经元内氧化应激引起的PPARγ活性下降可能是脱乙酰化酶依赖性的。
有研究证明小脑颗粒神经元中的HDAC4在低钾或谷氨酸处理后从胞浆转位到胞核,并且抑制转录因子MEF2和CREB(cAMP)应答元件结合蛋白)的转录。为了证明皮层神经元HDAC4在H2O2处理后是否有量和转位的变化,我们动态观察了HDAC4蛋白在全细胞、细胞浆和细胞核的表达变化情况,36μM的H2O2处理时间同前。Western Blotting结果显示,全细胞HDAC4蛋白水平在不同时间点变化不大；胞浆HDAC4蛋白水平随着处理时间的延长逐渐减少；胞核HDAC4蛋白水平随着处理时间的延长逐渐增加。免疫荧光细胞化学结果与之一致。提示HDAC4在氧化应激后可以从胞浆转位到核,有可能与核内转录因子作用。
因为HDAC4的脱乙酰化功能可以抑制下游基因的转录,我们应用PPARγ荧光素酶报告基因检测方法,检测了HDAC4对外源性和内源性PPARγ的转录活性的作用。培养的HEK293细胞分为四组,对照组由于HEK293细胞不表达PPARγ蛋白,所以PPARγ的转录活性非常低(3.18±0.41％)；外源件转入的PPARγ报告基因活性为100±7.25％；加入HDAC4后的PPARγ报告基因活性为27.00±1.21％；加入HDAC4和它的抑制剂TSA后PPARγ报告基因活性为103.57±9.53％。HDAC4组较PPARγ组有显著下降,差异具有统计学意义(P<0.001)；TSA能很好的逆转HDAC4所致的PPARγ活性的下降(P<0.05),提示HDAC4对PPARγ活性的抑制可能依赖于HDAC4的脱乙酰化功能。此结果证明HDAC4能够抑制外源性的PPARγ活性。接下来我们在培养的皮层神经元上进行了验证。HDAC4组PPARγ报告基因活性为29.30±11.04％,较对照组PPARγ报告基因活性为100±0.06％有统计学显著差异(P<0.05)。结果证明HDAC4亦能够抑制内源性的PPARγ活性。
接下来我们使用HDAC4特异性microRNA来验证氧化应激所致PPARγ活性的下降是细胞核积聚的HDAC4所致。我们首先在HEK293细胞上验证了RNA干扰的效果。结果显示HDAC4 miRNA1+2+3组能明显抑制共转HDAC4的表达。接下来在培养的皮层神经元上用PPARγ荧光素酶报告基因检测方法检测氧化应激处理下HDAC4 miRNA的效果。结果显示:PPARγ H2O2处理组报告基因活性为对照组的55.41±4.86％；control miRNA H2O2处理组PPARγ报告基因活性为对照组的63.48±5.25％；HDAC4 miRNA组H2O2处理组PPARγ报告基因活性为对照组的84.87±6.07％。HDAC4 miRNA组较PPARγ组有统计学差异(P<0.01)。结果发现氧化应激所致PPARγ活性的下降可以被HDAC4 miRNA所部分逆转,提示这种下降可能是细胞核积聚的HDAC4所致。
我们下一步用GST-pull down和免疫共沉淀的方法验证HDAC4是否在体外和真核细胞中均能与PPARγ相互作用。我们一方面用转染了Flag-HDAC4质粒的HEK293细胞裂解液与GST-PPARγ做体外结合实验,Western Blotting结果显示二者能够在体外结合；另一方面为了确定HDAC4与PPARγ的结合部位,我们做了HDAC4-N’(1-1950 bp,1-650氨基酸残基)和HDAC4-C’(1708-3255bp,569-1085氨基酸残基)与GST的融合蛋白,与转染了Flag-PPARγ的HEK293细胞裂解液进行体外结合实验。Western Blot结果显示PPARγ主要与HDAC4的氨基末端结合。为了进一步验证HDAC4-N’与PPARγ的作用是直接的,我们用GST-HDAC4-N’和His-PPARγ做了GST-pull down实验,结果证明HDAC4能与PPARγ在体外直接作用。我们用免疫共沉淀方法验证两种蛋白是否在真核细胞中也有这种相互作用,我们用PPARγ抗体分别沉淀单独转染质粒Flag-PPARγ或Flag-HDAC4和二者共转组的细胞裂解液,应用GST抗体作为对照。结果显示在真核细胞中HDAC4亦能与PPARγ相互作用。
过去的研究发现胞核定位的HDAC4能够通过转录抑制作用促进神经元的死亡,而过表达PPARγ能够增加神经元对应激的耐受,保护神经元免于死亡。所以氧化应激刺激下HDAC4对PPARγ活性的抑制可能逆转了PPARγ的神经保护作用。我们用神经元存活实验来验证PPARγ对HDAC4导致的神经元死亡的保护作用。转染24h后进行染色和细胞计数。皮层神经元转染Flag-PPARγ组的细胞死亡率为14.42±0.60％；转染GFP-HDAC4组的细胞死亡率为37.31±1.47％;共转Flag-PPARγ和GFP-HDAC4组的细胞死亡率为17.91±0.98％。共转Flag-PPARγ组能够保护部分神经元免于死亡,较HDAC4组有统计学差异(P<0.001)。我们接下来用HDAC4 miRNA来验证HDAC4调节通路在氧化应激所致神经元死亡中的作用。用control miRNA质粒和HDAC4 miRNA质粒分别转染神经元,染色后细胞计数结果显示:control miRNA组正常情况下细胞死亡率为10.25±1.39％,经过H2O2处理后的细胞死亡率为55.52±1.19％；HDAC4miRNA组正常情况下细胞死亡率为9.31±0.77％,经过H2O2处理后的细胞死亡率为33.16±0.79％。H2O2处理后HDAC4 miRNA组能挽救部分神经元免于死亡,较control miRNA组有显著的统计学差异(P<0.001)。
以前有研究证明神经元特异性敲除PPARγ能增加脑缺血后的脑损伤程度。我们用PPARγ特异性microRNA来验证PPARγ在氧化应激导致的神经元死亡中的作用。我们首先在HEK293细胞上验证了RNA干扰的效果。结果显示PPARγ miRNA1和PPARγ miRNA2均能明显抑制共转PPARγ的表达。接下来我们在神经元上分别转染control miRNA/PPARγ miRNA1/PPARγ miRNA2质粒。结果显示:control miRNA正常情况下的细胞死亡率为13.14±0.75％,H2O2处理后的细胞死亡率为22.07±0.80％；PPARγ miRNA1和PPARγ miRNA2组H2O2处理后的细胞死亡率分别为47.71±2.15％和47.00±0.58％。control miRNAH2O2组分别与PPARγ miRNA1(P<0.01)和PPARγ miRNA2(P<0.001)组相比差异具有统计学意义。结果提示干扰了内源性的PPARγ提高了神经元对氧化应激的易感性。
最后,我们过表达PPARγ于神经元来验证是否能使之抵抗氧化应激的损伤。神经元分别转染了GFP和Flag-PPARγ质粒。以GFP组作为对照,正常情况下的细胞死亡率为12.37±1.00％,H2O2处理后的细胞死亡率为56.24±0.99％；过表达PPARγ组正常情况下的细胞死亡率为10.63±0.59％,H2O2处理后的细胞死亡率为20.92±2.24％。过表达PPARγ可以逆转部分神经元免于死亡,较GFP H2O2组有显著的统计学差异(P<0.001)。提示PPARγ可以保护氧化应激导致的神经元损伤。
综上所述,氧化应激刺激下HDAC4可以抑制PPARγ的活性,从而导致神经元的死亡；降低PPARγ的表达增加了神经元对氧化应激的易感性；过量表达PPARγ可以保护部分神经元免于H2O2和HDAC4所致的死亡。