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目的： 免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig），是人体内分泌最多、分布最广的免疫活性分子。Ig是由两条重链和两条轻链组成的“Y”字形四肽结构。按重链（u、γ、α、δ、ε）氨基酸的不同序列分为五大类型：IgM，IgG，IgA，IgD和 IgE。IgG（immunoglobulin G）,约占免疫球蛋白总量的75％-85%，在血液、组织液中分布广泛，是体液免疫的重要组成部分。IgG4，是人体内含量最少的IgG亚型，在正常人体内占总IgG含量不到5%。近几年 IgG4由于 Fab段交换作用（Fab Arm Exchange，FAE）而备受关注，目前关于IgG4的研究主要集中在IgG4相关性疾病（IgG4-related disease，IgG4-RD）、炎症性疾病和自身免疫性疾病，极少涉及到恶性肿瘤。我们的实验发现 IgG4在食管癌组织中有显著升高，随后我们检测了食管癌病人血清中IgG4的含量，也存在这一趋势。为了探究肿瘤组织中以及血液循环中这种升高的趋势与临床病理分期是否相关，肿瘤病人体内的IgG4与正常人体内的 IgG4含量的差异是否有意义，IgG4在肿瘤免疫微环境中究竟扮演什么样角色。我们利用现有的资料和资源展开了一系列的实验。 方法： 75例肿瘤相关组织样本来自于汕头大学附属肿瘤医院病理科和汕头大学粤东地区病理会诊中心，59例食管癌病人血液样本来自于汕头大学附属肿瘤医院检验科，26例健康人血液样本来自于汕头大学志愿者,实验样本的收集和使用均已通过汕头大学医学院医学伦理委员会的审核、批准。免疫组化和染色-脱色-再染色（stain destain restain，SDS）技术：利用SDS技术在同一张切片上完成 IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4等4种抗原在食管癌肿瘤组织上表达的检测，经过软件处理后得到整合的图像。免疫荧光双重染色：在同一张组织切片上孵育两种不同来源的抗体，在食管癌组织上检测两种不同的抗原，用红绿两种荧光显示所检测的抗原，蓝色显示细胞核。IgG的提取：取健康人及肿瘤病人血浆，利用rProteinG亲和层析柱分离得到IgG。罗氏免疫比浊法检测血清中IgG4及全IgG的含量：检测收集的59例食管癌病人（病例组）和26例正常人（对照组）血清 IgG及 IgG4，计算 IgG4占总 IgG的比例，统计分析两组间差异。木瓜蛋白酶酶切：IgG在半胱氨酸存在的条件下，木瓜蛋白酶在 IgG铰链区以上的位置进行切割，干燥箱37℃震荡5小时，经过Protein A纯化，分离得到纯Fab，Fc段，离心浓缩测浓度，备用。蛋白质Biotin标记法：将蛋白与活化液混合，加入DEMO和Biotin，室温震荡40分钟。充分反应后用除盐柱将标记好Biotin的蛋白质纯化，放4℃冰箱储存，备用。将蛋白酶切得到的产物，经过SDS-PAGE电泳，硝酸银染色，鉴定 IgG、IgG亚型以及酶切后得到的各类IgG组分。蛋白质免疫印迹：将标记上 Biotin的 IgG4作为一抗，和转移在硝酸纤维素膜上的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgG1的Fab、Fc孵育，检测蛋白之间的反应。 结果： 在免疫组化中，食管癌病人肿瘤组织中 IgG4阳性浆细胞数，比癌旁组织、正常组织多，并且IgG4的水平升高与病人的临床病理分期有相关关系。免疫荧光双重染色中，IgG4和 IgG1、IgG2、IgG3阳性细胞不重叠，并且 IgG4阳性细胞比例较高。SDS中， IgG4、IgG1、IgG2、IgG3在同一组织切片上染色，高倍镜下同一视野内， IgG4/IgGtotal相对比例较高。IgG4含量和IgG4的相对水平（IgG4/IgGtotal）在食管癌病人血清中比正常人高，且具有统计学意义(IgG4：P<0.0001；IgG4/IgG：P=0.003）。western blot中 Biotin标记的 IgG4和 IgG四种亚型在50KD位置附近有反应条带；Biotin标记的 IgG4 Fab片段和 IgG1的 Fab片段没有反应条带，而与 IgG1的 Fc片段在30KD位置附近有反应条带。另外，IgG4的重链在50KD的附近位置有两条不同大小的条带，并且IgG4的Fab片段在25KD的附近位置也有两条大小不同的条带。 结论： 在食管癌病人体内IgG4含量及 IgG4/IgGtotal水平升高，并且 IgG4的升高与肿瘤病人的临床病理分期有相关关系，说明 IgG4在免疫系统可能是免疫负调控的终产物，机体面对长期存在的抗原无法有效清除而产生的一种妥协状态。通过免疫组化、免疫荧光双重染色、木瓜蛋白酶酶切、western blotting、ADCC等实验证明，IgG4由浆细胞产生，四种IgG亚型由不同的浆细胞分泌，四种亚型之间不交叉， IgG4能够和 IgG各亚型反应， IgG4通过Fab段能够和IgG1的Fc段发生反应。据此，推测IgG4作为blocking antibody通过与肿瘤杀伤性性抗体 IgG1的 Fc段结合，从而干扰 IgG1与补体、FcR结合，下调IgG1介导的ADCC、ADCP作用。IgG4下调细胞免疫反应的作用这一机制为肿瘤的体液免疫也提供新的认识，也为肿瘤的治疗提供新的思路。