枇杷叶内生菌与金龟子绿僵菌对熊果酸的生物转化研究

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熊果酸(Ursolic Acid)是存在于天然植物中的一种三萜类化合物,分子式为C30H48O3,具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗溃疡、降低血糖等多种生物学效应,熊果酸还具有明显的抗氧化功能,因而被广泛地用作医药和化妆品原料。但是熊果酸生物利用度低,制剂种类单一,限制了其生物活性的开发。修饰改造其分子结构,从而提高生物利用度,达到创制新药的目的。本研究旨在利用微生物对熊果酸进行生物转化,研究从两条思路寻找可对熊果酸进行生物转化的真菌,一条为从外界常用萜类物质的生物转化菌株中筛选;另一条为从含有多种三萜酸的枇杷叶入手寻找可对熊果酸进行转化的真菌。  首先,建立了熊果酸以及科罗索酸的检测方法。结果表明:通过对展开剂和显色剂的筛选,确定TLC定性分析法的展开条件为环己烷:乙酸乙酯:乙酸=4:1.5:2滴,显色剂为10%的硫酸乙醇溶液;确定HPLC检测法的条件为流动相为乙腈:水=85:15,等梯度洗脱,检测波长为210 nm,流速是1.0 mL/min,温度为32℃,熊果酸的标准曲线R2=0.9992,线性范围为0.8~4.0μg;科罗索酸的标准曲线R2=0.9996,线性范围为0.8~4.0μg。  其次,通过HPLC检测法对七种新鲜枇杷叶熊果酸及科罗索酸的含量进行了测定。结果表明:窄叶、解放钟和茂木三个品种的枇杷叶中科罗索酸的含量最高。从三种新鲜枇杷叶窄叶、解放钟和茂木中提取内生菌,得到一种形态一致的菌,命名为枇杷叶内生菌1,其对熊果酸有生物转化作用,生成萜类物质。  再次,利用金龟子绿僵菌(购自上海中科院研究所)、黑根霉122、123、124、赭曲霉(购自广东省菌种保藏中心)以及青霉、绿僵菌2(华南农业大学资源与环境学院)对熊果酸进行生物转化,发现金龟子绿僵菌与熊果酸进行发酵培养可得到一种含量很高的白色针状晶体,其熔点为202~205℃,高温易溶于甲醇,并对其结构进行了研究,得到初步的结构推测。  最后研究了金龟子绿僵菌转化熊果酸的条件对针状晶体生成量的影响,并对主要考察因素转化温度、培养基pH、摇床转速进行了正交优化。得到最佳转化条件为培养基pH为6.5,转化时间为72 h,摇床转速为160 rpm,反应温度为28℃,接种量为106个/mL。
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