论文部分内容阅读
L-组氨酸参与机体生长发育、抗氧化和免疫调节等重要的生理过程，被广泛应用于医药、食品和饲料工业。目前，L-组氨酸生产主要采用蛋白质水解提取法，国外仅有少数关于微生物发酵法生产的研究报道。然而，国内关于微生物发酵法生产L-组氨酸的研究十分有限，仅能依靠蛋白质水解提取法进行小规模的低等级的L-组氨酸生产，医药级L-组氨酸绝大部分依靠进口。L-组氨酸生产菌株的选育主要采用多轮传统诱变筛选和在诱变菌株的基础上进行基因工程改造的方法。通过诱变筛选获得的菌株可能积累大量的负效应突变，导致菌株生长缓慢、环境耐受性降低以及营养需求增高等问题。这些缺陷限制了菌株的进一步改造和发酵条件的优化。L-组氨酸的生物合成具有与核苷酸合成竞争前体物质、复杂的代谢调控机制以及合成过程中高能量需求等特点，导致其工程菌的产酸水平和转化率相对较低。通过以分子生物学技术为基础的代谢工程改造，大量具有工业应用潜力的氨基酸工程菌已经被成功构建，然而通过系统代谢工程改造构建L-组氨酸工程菌的报道极为少见。作为代谢网络的重要组成部分，膜转运系统对于氨基酸的代谢和积累起到非常重要的作用。跨膜转运系统是微生物细胞与外界环境交流的通道，对于维持细胞内环境稳定和适应不断变化的外部环境至关重要，同时也是影响氨基酸生产菌生产性能的重要因素。目前，谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）的多数氨基酸转运蛋白已被鉴定，然而，L-组氨酸的转运系统仍没有详细的研究报道。本论文针对上述L-组氨酸生产菌株选育和代谢网络研究方面的问题，以谷氨酸棒杆菌野生型为出发菌株，首次从头构建了遗传背景清楚的L-组氨酸基因工程菌。同时，在分子水平上鉴定了谷氨酸棒杆菌的L-组氨酸吸收转运蛋白，并对其功能和生理生化性质的分子结构基础进行了研究。 本研究在对谷氨酸棒杆菌代谢网络分析的基础上，以谷氨酸棒杆菌野生型为出发菌株，通过增强L-组氨酸合成基因簇的表达，解除L-组氨酸对其合成关键酶ATP-磷酸核糖转移酶(ATP phosphoribosyltransferase，ATP-PRT)的反馈抑制调节，同时过表达PRPP合成酶(PRPP synthetase)和解除反馈抑制的ATP-PRT进一步增加L-组氨酸的合成前体PRPP的供给和L-组氨酸合成途径的代谢通量的策略，对L-组氨酸终端合成途径进行了系统的代谢工程改造，实现了谷氨酸棒杆菌的L-组氨酸积累。在此基础上，进一步对中心碳代谢途径进行了不同策略的改造，包括缺失磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase)编码基因pgi以阻断上游的糖酵解途径，过表达戊糖磷酸途径关键酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)以增加戊糖磷酸途径的代谢容量，以及这两种策略的组合的方式，调节中心代谢途径中碳代谢流量的分配。结果表明，在pgi基因缺失的基础上，过表达G6PDH能够缓解pgi基因缺失所造成的菌株的生长缓慢和葡萄糖代谢能力的减弱，实现了在增加戊糖磷酸途径代谢流量的同时将胞内ATP维持在较高的水平，这种中心代谢途径的改造使L-组氨酸产量提高了102％。所构建的工程菌L-组氨酸的最高产量为63.23 mmol/L(9.8 g/L)。本论文所采用的中心碳代谢途径改造策略，成功的实现了将代谢流导向戊糖磷酸途径的同时增强戊糖磷酸途径的葡萄糖代谢能力，为其它戊糖磷酸途径的代谢产物的代谢工程改造提供了参考和依据。 本文通过菌株的生长实验和L-组氨酸的吸收转运实验鉴定了谷氨酸棒杆菌的芳香族氨基酸吸收转运蛋白AroP具有吸收转运L-组氨酸的功能。AroP转运L-组氨酸的Km值为11.40±2.03μmol/L，是一个中等亲和力的L-组氨酸吸收转运蛋白。AroP蛋白介导的L-组氨酸的吸收转运受其它三种氨基酸底物（L-色氨酸、L-酪氨酸和L-苯丙氨酸）的竞争性抑制。在四种氨基酸底物中，AroP具有如下的底物偏好性顺序:L-色氨酸＞L-酪氨酸＞L-苯丙氨酸＞L-组氨酸。在此基础上，通过同源建模和分子对接模拟预测，分析了AroP蛋白的底物结合方式和底物转运的分子变构过程。与底物偏好性分析实验的结果一致，L-色氨酸因其具有最佳的空间适配性、最强的疏水作用力和最低的结合自由能而成为匹配底物结合口袋的最适底物。通过对预测的关键的底物结合位点进行突变实验验证，确定了Ser24，Ala28和Gly29在底物结合过程中起关键作用。系统进化树分析发现，AroP蛋白在细菌中具有一定的保守性，而其底物结合的关键位点在革兰氏阳性菌中高度保守。另外，aroP基因的表达不受胞外存在的氨基酸底物的影响，推测AroP蛋白的生理功能为吸收环境中存在的氨基酸以避免从头合成这些氨基酸造成的物质和能量浪费，以此增强谷氨酸棒杆菌的环境适应性。