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背景和目的癫痫是儿童时期常见的慢性神经系统疾病,70-80%的癫痫患者通过抗癫痫药物的治疗能控制癫痫的发作,但仍有20-30%左右的癫痫患者在接受规范合理的抗癫痫药物治疗后依然有发作而成为难治性癫痫。颞叶癫痫在难治癫痫中最常见,一直以来都是癫痫治疗的难点。大量研究表明,颞叶癫痫的反复发作可致海马区神经元的丢失及海马硬化,这不仅对病人的生活、工作产生巨大的影响,也给患者的家庭和社会造成了很大的负担。目前的抗癫痫药物主要作用于离子通道,抑制神经元的兴奋性,进行对症治疗。深入研究癫痫的病因和发病机制,针对发作机制中的关键环节发现新药物、寻求新的治疗途径,是癫痫治疗未来发展的方向。近年来越来越多的研究表明:癫痫与炎症密切相关,高迁移率族蛋白1(High mobility group protein 1,HMGB1)是一种重要的细胞炎症因子,正常情况下主要存在于细胞核中,参与维持核小体的结构和基因转录的调控,当发生组织损伤时迅速从损伤的神经元、小胶质细胞和星形胶质释放到细胞外、脑脊液及血清中,它的释放是触发免疫反应的危险信号,在脓毒症、关节炎等多疾病中具有重要的作用,最新研究发现其与癫痫的发生也有着紧密的联系。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)是一种识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的受体,能识别损伤或应激所致的“内源性危险信号”如:HMGB1,激活核转录因子kappa B(Nuclear factor-k-gene binding,NF-κB)发生磷酸化,磷酸化的NF-κB(Phosphorylated Nuclear factor-k-gene binding,p-NF-κB)进入细胞核,诱导促炎因子基因表达,脑内炎症导致癫痫反复发作。而甘草类药物有较好的抗炎、抗过敏和细胞膜保护作用,并且有较高的安全性和耐受性,临床上已广泛用来治疗肝炎、皮肤病等,最近国内外有研究表明甘草甜素(Glycyrrhizin,GL)作为HMGB1的小分子抑制剂,在炎症抑制方面有一定作用,并且有较好的安全性和耐受性,且部分药物可穿过血脑屏障,有望成为抗癫痫药物的候选者,但关于甘草类药物的神经元保护及抗癫痫作用的机制,目前还缺乏临床及实验数据的支持。本研究在用海人酸(Kainic acid,KA)诱导建立幼鼠颞叶癫痫模型的基础上,采用甘草甜素(Glycyrrhizin,GL)预处理,通过观察行为学表现,探讨甘草甜素对海人酸诱导幼鼠癫痫发作的敏感性及严重性的影响,利用Western blot与Q-RT-PCR分别从蛋白质与mRNA水平检测海马组织HMGB1/TLR4/p-NF-κB的表达,运用HE染色及免疫组化从细胞凋亡水平观察海马区神经元的丢失情况,探讨甘草甜素可能的抗癫痫及神经保护机制,及其与脑内免疫炎性反应的关系,有望老药新用,找到癫痫治疗的新方向并为其提供理论依据。材料与方法出生21天的SD大鼠,随机分为对照组、模型Ⅰ组、模型Ⅱ组。模型Ⅰ组用KA诱导癫痫发作,模型Ⅱ组在应用KA前30min腹腔注射GL,模型Ⅰ组根据观察时间点不同分为3h、12h、24h、7d四个亚组,模型Ⅱ组根据GL不同剂量分为10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg三个亚组,每个亚组3只动物,行为学表现按照Racine评分量表进行评分,RT-PCR检测急性期(3h、12h、24h)海马区HMGB1/TLR-4 mRNA的表达,Western blot检测HMGB1/TLR-4/p-NF-κB蛋白的表达,Elisa检测血清中HMGB1蛋白的表达变化,免疫组化检测慢性期(7d)海马神经元抗核抗体(Neu-N)的表达。结果1.行为学结果:模型Ⅰ组SE发生率为75%,死亡4只,存活率为:67.3%,SOT:24.08±1.98min;模型Ⅱ组SE发生率为64.3%,总共死亡6只,存活率85.7%,SOT:33.39±2.66min;生理盐水对照组大鼠均未死亡,存活率为100%;GL预处理模型Ⅱ组与模型Ⅰ组比较,SE发生率降低,存活率增高,SOT时间延长。2.癫痫急性期海马区HMGB1/TLR-4基因表达结果:模型Ⅰ组与对照组比较,随着观察时间(3h、12h、24h)的延长,HMGB1、TLR-4基因表达升高,其中12h时达到峰值(差异具有统计学意义,P<0.05),12h时间点,其中模型Ⅱ组HMGB1、TLR-4基因表达量较模型Ⅰ组显著降低(差异具有统计学意义,P<0.05),不同剂量的干预的模型Ⅱ组之间无显著差异(P>0.05)。3.癫痫急性期海马区HMGB1/TLR-4/p-NF-κB蛋白表达结果:模型Ⅰ组与对照组比较,随着观察时间(3h、12h、24h)的延长,TLR-4、p-NF-kB蛋白表达升高,其中12h时达到峰值(差异具有统计学意义,P<0.05),HMGB1的蛋白表达没有明显变化(P>0.05)。在12小时的时间点,模型Ⅱ组TLR-4、p-NF-k B蛋白表达量较模型Ⅰ组显著降低(差异具有统计学意义,P<0.05),不同剂量的干预的模型Ⅱ组之间差异不大(P>0.05)。4.癫痫急性期血清中HMGB1表达结果:模型Ⅰ组与对照组比较,血清中HMGB1浓度增高,其中12h时明显(差异具有统计学意义,P<0.05),在12h的时间点,模型Ⅱ组与模型Ⅰ组比较,血清中HMGB1的浓度显著降低(差异具有统计学意义,P<0.05),不同剂量的干预的模型Ⅱ组之间差异不大(P>0.05)。5.慢性期海马区Neu-N表达结果:模型Ⅰ组与对照组比较,海马区神经元显著丢失(差异具有统计学意义,P<0.05),模型Ⅱ组与模型Ⅰ组比较,海马区神经元的丢失显著减少(差异具有统计学意义,P<0.05),不同剂量的干预的模型Ⅱ组之间差异不大(P>0.05)。结论1.GL预处理可以延长幼鼠癫痫发作的潜伏期,降低癫痫发作的易感性,减轻幼鼠癫痫的发作。2.幼鼠癫痫急性期海马HMGB1/TLR-4基因表达增加,TLR-4的蛋白表达增高,诱导NF-κB的磷酸化。3.GL预处理可以降低HMGB1的基因合成及释放,降低胞外HMGB1浓度,降低TLR-4的基因表达及蛋白合成,抑制NF-κB的磷酸化。4.GL预处理能减轻癫痫所致的海马区病理性损害,预防神经元的丢失,发挥一定的神经保护作用。