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前言:喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)是头颈部常见的恶性肿瘤之一。在我国特别是东北地区,喉癌的发病率呈现上升的趋势。喉癌发生发展分子机制的研究将为喉癌预防和诊治提供重要的分子靶标。尽管目前的研究已经发现若干用于评价喉癌进展的可能生物学标志物,但是它们尚未在临床工作中得到实际应用。因此对喉癌进行早期诊断,并在基因水平寻求新的诊治标志物成为当前亟需解决的问题。
前期,我喉癌课题组的比较基因组杂交研究结果显示1p缺失常见于喉鳞状细胞癌。1p,特别是1p36是多种恶性肿瘤最常见的缺失部位之一,近30年来,国内外相关研究小组试图在该染色体区域内筛选出一个或多个肿瘤抑制基因。2007年,Bagchi等应用染色体工程技术构建了1p36增益和缺失小鼠模型,进一步研究证实染色质域解旋酶DNA结合蛋白5(chromodomain helicase DNA-bindingprotein5,chd5)基因位于该染色体区,具有控制细胞增殖、凋亡和衰老的功能,提示其可能是一重要候选肿瘤抑制基因。肿瘤抑制基因在疾病的发生和发展中扮演非常重要的作用,其序列改变可以造成基因表达的异常进而引起表型的变化,同时,其表达水平还受表观遗传的控制。表观遗传调控机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰和RNA干涉等,而DNA甲基化是表观遗传学研究最深入、最重要的一种机制,与许多疾病如肿瘤的发生和发展密切相关。在喉癌研究中,已经发现P16ink4a,ECAD,DAPK,MUM和FHIT等多种肿瘤抑制基因发生异常甲基化改变并且具有肿瘤特异性,而且,多基因甲基化的肿瘤患者往往预后较差。最近的研究发现,在多种恶性肿瘤如神经母细胞瘤、胃癌、卵巢癌、直肠癌和乳腺癌组织中,CHD5启动子区呈现异常甲基化,可以导致该基因表达沉默。
人类CHD5基因定位于1p36,包含42个外显子,编码的蛋白质分子量约为223Kd,属于CHD蛋白质家族的第5个成员。CHD家族是染色质重塑酶SNF2蛋白超级家族的成员。这类蛋白质通过改变核小体DNA的亲和性而影响染色质的结构,即屏蔽某个DNA区域的同时暴露其他部位,从而参与细胞的调节。然而,CHD5参与肿瘤发生的机制仍不十分清楚,迄今未见其与喉癌发生相关性的研究报道。本研究旨在探讨CHD5基因在喉癌发生中的作用及可能的分子机制。
材料与方法:
以临床喉癌标本和喉癌Hep2细胞系为实验材料,应用免疫组织化学染色法、real time-PCR和Western Blot检测喉癌组织中CHD5基因的表达情况。应用硫化测序PCR(Bisulfate Sequencing PCR,BSP)方法检测喉癌组织中CHD5基因DNA甲基化情况。统计分析喉癌患者的临床资料与CHD5基因表达和甲基化情况的相互关系,探讨CHD5与喉癌发生、发展的相互关系。利用生物信息学软件预测可能与CHD5基因上游启动子区特异序列结合的转录因子,并用EMSA和ChIP技术对预测结果进行验证以评价CHD5启动子区特异甲基化序列与相关反式作用元件的结合能力。构建CHD5基因表达载体,将其转染喉癌Hep2细胞系,通过realtime PCR和Western Blot检测转染前后喉癌Hep2细胞中CHD5基因表达水平以评价转染效率,同时,应用MTT、流式细胞术和Transwell方法分别检测CHD5基因过度表达对Hep2细胞生物学特性的影响。
结果:
1.免疫组化染色、real time-PCR和Western blot检测结果显示,人喉癌组织中CHD5 mRNA和蛋白表达水平均高于癌旁对照组织,而在Hep-2细胞中几乎未检测到CHD5基因的表达;
2.BSP检测结果表明,在人喉癌组织中CHD5基因启动子存在过度甲基化,且与CHD5基因表达下调相关,且Hep-2细胞中CHD5基因启动子区DNA表现为完全甲基化;
3.喉癌肿瘤组织中CHD5的mRNA和蛋白质表达水平与喉癌患者的TNM分期有关,与患者的性别、年龄和肿瘤发生部位无关;
4.喉癌组织CHD5蛋白质表达水平与CHD5启动子区过度甲基化以及患者年龄相关,与患者的性别、肿瘤发生部位不相关;
5.CHD5启动子区转录因子结合位点的预测结果表明,经Matinspector软件预测发生异常甲基化的CHD5启动子区中发现存在P53、E2F-MYC激活子和RNA聚合酶Ⅱ转录因子ⅡB的结合位点,其中,P53结合位点的甲基化频率最高;
6.EMSA实验结果显示在体外p53可以和去甲基化CHD5序列结合,而不能与甲基化CHD5序列特异性结合;
7.ChIP检测结果证明在体内p53与去甲基化CHD5序列特异性结合,DNA过度甲基化抑制二者的结合;
8.转染pcDNA3.1-CHD548小时后,Hep2细胞的CHD5 mRNA和蛋白表达水平较对照组显著升高;
9.与对照组相比,转染pcDNA3.1-CHD5组的Hep2细胞的增殖能力和侵袭力显著降低、凋亡率显著升高。
结论:
1.CHD5基因在喉癌组织组织中表达下调,并且与患者的肿瘤TNM分期有关,提示其可能参与喉癌的发生和发展;
2.CHD5基因启动子区异常甲基化可能是引起喉鳞癌中CHD5表达下调的原因之一,且与患者的肿瘤组织中TNM分期和患者年龄有关;
3.p53可以与CHD5基因特异性结合,其中p53结合位点的甲基化状态影响二者的结合能力;
4.CHD5基因具有抑制喉癌细胞的增殖和侵袭、促进细胞凋亡的能力,提示其是在喉癌中发挥肿瘤抑制基因的作用。