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背景
医用臭氧发展有近50年历史,在欧洲等地医用臭氧(以下简称臭氧)用于治疗糖尿病足、创伤及皮肤溃疡的愈合、脑中风、溃疡性结肠炎、关节炎、椎间盘突出症等疾病,临床疗效得到了肯定。
目的
以兔VX2移植瘤为实验对象,采用不同浓度的臭氧行经皮穿刺瘤内注射,并采用瘤内注射纯氧及空白治疗作为对照,观察不同浓度臭氧的治疗疗效,同时阐述其治疗机理。
结果
一、动物模型制作及治疗:
兔右侧臀部外侧大腿根部皮下VX2瘤株接种成功率85％,共计有34只瘤兔造模成功,接种14d,体外测量肿瘤直径为2.06±0.93cm。
二、术后观察
(一)、一般情况:各组实验兔治疗后反应,活动及进食情况与术前相比较无明显变化。
(二)、疗效评估
1.空白组和纯氧组:两组瘤兔肿瘤长径及短径均较前明显增大,空白组长径4.10±0.71cm；短径3.29±0.60cm。纯氧组长径3.73±0.51cm；短径3.34±0.50cm。两组肿瘤标本表现相似:肿瘤形态欠规则,部分为类圆形,部分近似长方形。切面呈灰红色,鲜嫩似鱼肉状,有光泽,中心区域可见乳白色液化坏死,坏死范围长径1～2cm。空白组和纯氧组共计有9只瘤兔解剖后发现转移灶。空白组:3只瘤兔臀部瘤灶附近可见肿大淋巴结(其中一只合并肺转移)；1只瘤兔单独出现肺脏转移瘤；1只瘤兔单独出现肝脏转移瘤。纯氧组:3只瘤兔臀部瘤灶附近可见肿大淋巴结(其中1只合并有肝脏转移)；1只瘤兔单独出现肺部转移。
2.50μg组和75μg组(臭氧组,下同)瘤兔肿瘤较治疗前相比较增大不明显,50μg组肿瘤长径2.41±0.37cm；短径2.28±0.27cm。75μg组肿瘤长径2.41±0.32cm；肿瘤短径2.27±0.29cm。两组肿瘤标本表现相似:瘤体色暗红,局部可见充血肿胀,中心区域可见浅黄色及少许乳白色相杂坏死,瘤腔内坏死物部分可见液化,坏死腔较小,坏死范围长径0.5～1cm。臭氧组2只瘤兔股部出现转移淋巴结,其它部位未见转移灶。臭氧组和空白组及纯氧组三组间肿瘤转移率相比较显示总体间有显著统计学差异(P=0.01),空白组肿瘤转移率最高(71.4％):纯氧治疗组次之(50.0％)；臭氧治疗组肿瘤转移率最低(11.8％)
3.各组间肿瘤最长径和最短径进行统计学比较,肿瘤长径50μg组和75μg组显著低于空白组及纯氧组(P<0.05)；50μg组和75μg组比较无明显统计学差异(P=0.995)；空白组和纯氧组比较无明显统计学意义(P=0.148)。肿瘤短径50μg组和75μg组显著低于空白组及纯氧组(P<0.05)；50μg组和75μg组比较无显著统计学差异(P=1.000):空白组和纯氧组比较无显著统计学意义(P=1.000)。
4.各组间瘤重分别是:空白组27.57±6.29g；50μg组17.63±3.30g；75μg组19.89±3.66g；纯氧组27.50±7.76g。50μg和75μg组肿瘤瘤重显著低于空白组及纯氧组(P<0.05)；臭氧组之间相比较无显著统计学意义(P=0.403)；纯氧组和空白组相比较无显著性统计学差异(P=0.980)。
(三)、外周静脉血检测
治疗前1d抽取外周静脉血检查NKC和细胞因子IL-2、TNFα、IFNγ数值,治疗14d后再次抽取静脉血测量上述数值(各组数字详见正文)。50μg组和75μg组NKC、IL-2、TNFα、IFN,数值均显著高于空白组及纯氧组,各组间差值(差值=治疗后数值-治疗前数值)行统计学两两比较:50μg组和75μg组显著高于空白组及纯氧组(P<0.05)；NKC、IL-2及IFNγ差值50μg组和75μg组之间相比较无显著统计学意义(P>0.05)；TNFα差值50μg组和75μg组之间相比较有统计学差异(P<0.05)；空白组和纯氧组NKC及细胞因子差值之间相比较无统计学差异(P>0.05)。治疗前后各组间NKC及细胞因子数值(各组数字见正文)前后进行配对t检验显示:NKC空白组及臭氧治疗组治疗前后相比较有显著统计学差异(P<0.05)；纯氧组治疗前后无显著统计学差异(P>0.05)。臭氧组细胞因子前后数值比较有显著统计学差异(P<0.05)；空白组及纯氧组前后细胞因子数值相比较无显著统计学意义。
(四)、病理检查
1.HE染色光镜检查,①空白组和纯氧组:VX2肿瘤组织呈浸润性生长,部分肿瘤细胞突破肌肉,沿肌间隙生长,肿瘤细胞排列紊乱,可见多个癌巢,细胞核较大,大部分核呈异性,核质颗粒较粗,细胞间界限不清,可见粗大的肿瘤血管。部分组织切片可见少许肿瘤细胞破裂溶解,并可见正常肿瘤细胞内少许肿瘤坏死区。②臭氧组:肿瘤细胞与周边组织界限清晰,未见明显侵犯,肿瘤细胞可见大片凝固性坏死,癌巢较少见,瘤细胞大量溶解破裂,仅见少许肿瘤细胞存在,胞内结构破坏明显,细胞核不大,细胞间界限较清,瘤组织局部微血管充血、扩张,可见部分灶性出血点。
2.免疫组织化学检测
①PCNA阳性染色为细胞核膜周围及核内被染成黄色或棕黄色,呈颗粒状或弥漫样分布。PCNA阳性细胞呈弥漫样、小片状或颗粒样散在分布。各组间LI分别为空白组69.74±7.17％；50μg组37.26±7.42％；75μg组35.38±5.92％；纯氧组73.04±8.70％。各组间统计学两两比较:50μg组和75μg组LI显著低于空白组及纯氧组(P=0.000)；50μg组和75μg组之间相比较无显著统计学意义(P=0.601)；空白组和纯氧组之间相比较,无显著统计学差异(P=0.392)。
②MVD阳性染色为肿瘤组织中内皮细胞呈现不同程度的棕黄色,肿瘤微血管分布不均,表现出明显的异质性,以癌巢周边特别是肿瘤周边比较密集,坏死的肿瘤组织周边也可见到血管分布。MVD分别为空白组38.50±3.49；50μg组25.51±3.00:75μg组24.64±4.24；纯氧组37.68±3.66。各组间两两比较:50μg组和75μg组显著低于空白组及纯氧组(P=0.000)；50μg组和75μg组之间相比较无显著统计学意义(P=0.629)；空白组和纯氧组之间相比较,无显著统计学差异(P=0.666)。
③bcl-2和bax阳性染色为棕黄色,染色位于bcl-2和bax蛋白表达阳性细胞胞浆,呈弥漫性分布,核膜周围最浓,可见棕黄色颗粒。各组间bcl-2蛋白表达IOD分别是空白组25.28±9.66；50μg组9.63±1.67；75μg组9.35±1.03；空白组20.92±8.50。各组间bax蛋白表达IOD分别是空白组7.51±1.77；50μg组17.68±4.99；75μg组17.25±7.09；纯氧组8.46±1.52。bcl-2蛋白表达IOD各组间两两比较:50μg组和75μg组显著低于空白组及纯氧组(P<0.05)；50μg组和75μg组之间相比较无显著统计学意义(P=0.998)；空白组和纯氧组之间相比较,无显著统计学差异(P=0.919)。bax蛋白表达IOD各组间统计学两两比较:50μg组和75μg组显著高于空白组及纯氧组(P<0.05)；50μg组和75μg组之间相比较无显著统计学意义(P=1.000)；空白组和纯氧组之间相比较,无显著统计学差异(P=0.831)。
④TUNEL法检测凋亡细胞,凋亡细胞体积明显缩小,断裂为多个碎块状；凋亡细胞核呈棕色,显示细胞核内有原位断端修复酶表达。臭氧组观察切片后发现凋亡细胞核呈棕黄色,细胞凋亡多而广泛,染色质凝聚浓缩。空白组和纯氧组可见少许凋亡细胞,散在分布,细胞核染色较淡。分别计算各组的肿瘤AI:空白组14.86±5.34％；50μg组66.75±12.27％；75μg组73.22±12.80％；纯氧组14.25±3.50％。
结论
1.疗效总结:采用经皮穿刺瘤内直接注射臭氧治疗移植性兔VX2肿瘤,可有效控制肿瘤的生长,减少肿瘤转移,纯氧无明显抑制效应。
2.机理总结:①臭氧为强氧化剂,注入机体后生成活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)和氧自由基,具有明显的细胞毒性作用,能够直接杀死肿瘤细胞。②免疫激活和调节作用,诱导和产生各种细胞因子IL-2、TNFα、IFNγ,激活NKC从而引起肿瘤细胞死亡。③臭氧抑制瘤内组织PCNA、MVD、bcl-2蛋白的表达,上调bax蛋白的表达,诱导细胞的凋亡,从而有效的控制肿瘤的生长增殖。