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研究背景: 胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP)是一种核苷代谢酶,其生理学作用主要体现在:在体内特异性的催化胸苷去磷酸化,生成胸腺嘧啶和2-脱氧核糖-1-磷酸,为核酸补救合成途径提供原料;在体外刺激内皮细胞趋化和生长,在体内促进血管新生;此外抑制由于生理应激、免疫监视和抗肿瘤治疗等引起的细胞凋亡。TP在许多实体瘤活性较高,而在肿瘤组织中,TP的活性又明显高于相邻的正常组织,因此TP对于评价和改善肿瘤预后,指导化疗用药提供数据参考。TP是5-脱氧氟尿苷(5-deoxy-5-fluorouridine,5ˊ-DFUR)等5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)前体药物转化为5-FU的关键限速酶。由于肿瘤组织中TP的表达水平高于周围正常的组织,所以临床上5-FU的前体药物进入患者体内后在肿瘤组织中更容易转化为5-FU,这种治疗就具有较高的靶向性。这便有效地克服了5-FU常对黏膜上皮细胞等正常组织细胞表现出细胞毒性反应的毒副作用。 慢病毒载体(Lentiviral vector,LVs)是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统,它既可感染分裂细胞,也可感染非分裂细胞,如神经细胞、造血干细胞、肝细胞等,还具有整合到宿主细胞基因组、稳定长效转染、感染效率高等优点,能高效将目的基因(或RNAi)导入动物和人的原代细胞或细胞系。这些特点有效的克服了脂质体等传统转染载体转染效率低,很难稳定传代的缺点。因此,近年来越来越多的学者开始使用慢病毒转染目的基因,以获得TP高表达的人结肠癌细胞株。 目的: 以慢病毒为载体转染转染胸苷磷酸化酶(TP)cDNA给人结肠癌细胞株SW480和LOVO,建立表达高度活性TP的稳定细胞株。 方法: 构建包含TPcDNA全长的真核表达载体,用慢病毒包装后转染结肠癌细胞SW480和LOVO,流式细胞仪检测转染效率,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测TPmRNA的表达,蛋白印迹法(Western Blot)检测TP蛋白的表达。 结果: 转染TPcDNA后的SW480-TP与LOVO-TP监测5代,感染效率稳定在95％左右。两株转染细胞的TPmRNA表达分别比野生型细胞增加了694.56倍(P<0.01)和282.46倍(P<0.05),TP蛋白表达也明显增强。 结论:慢病毒载体能够高效地将TPcDNA转染至人结肠癌细胞SW480和LOVO并稳定传代,转染后两株细胞的TPmRNA和TP蛋白表达明显增高。