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研究背景：
紫外线(ultraviolet,UV)是电磁波谱中波长为100～400nm的辐射的总称,人类社会活动中接触到的紫外线主要来源于太阳辐射和一些人工光源,其中来自太阳的紫外线约占太阳光谱的5％。根据紫外线的波长和生物学效应的不同,可以分为3个波段:长波紫外线 UVA(long-wave ultraviolet,320～400nm),能穿透人类皮肤真皮层；中波紫外线 UVB(290～320nm),可穿透皮肤几毫米；短波紫外线UVC(short-waveultraviolet,200～290nm),穿透力较弱,是紫外线辐射杀菌的主要部分。由于地球上方臭氧层的阻挡和过滤作用,使太阳紫外线中全部的UVC和大部分UVB被屏蔽,从而使到达地球表面的紫外线绝大部分的是UVA(约占90-99％)和少量的UVB(约占1-10％),尽管UVB的含量较低,但是UVB的致癌能力却是 UVA的1,000到10,000倍。
UVB是已经被确认的自然环境中的环境致癌因子,臭氧空洞的形成和扩大使得到达地球表面的紫外线辐射量(尤其是IYVB)较以往增多,随之而来的皮肤疾病和皮肤癌的发病率也呈逐年上升的趋势,全球范围内,每年新增大约2,500,000例非黑素瘤皮肤癌患者和132,000例恶性黑素瘤患者,在日光下的慢性照射是基底细胞癌(BCCs)和鳞状细胞癌(SCCs)发生的主要原因,BCCs和SCCs同样都发病于皮肤基底层,SCCs具有侵袭性,超过10％的SCCs能够发生迁移,而BCCs不会发生迁移,但是其在局部具有较强的侵袭性和毁坏性。目前,对UVB致皮肤损伤机制的研究已经是国内及国际学术界和医疗界的热点问题。
皮肤是人体最大的器官,覆盖于机体表面,在对抗外界环境的物理、化学和生物等刺激时起到机械屏障和保护作用,皮肤的角质细胞还参与各种细胞生物学进程,如免疫、炎症、增生以及肿瘤转化等,同时又与体内各脏器有着紧密的联系,从而维持机体内环境的稳定。正因为皮肤裸露于外环境中,它比其它器官接受更多来自外界环境紫外线的辐射,角质层处在皮肤的最外层,角质形成细胞占表皮细胞的90％以上,是 UVB作用的主要靶细胞,照射到皮肤的紫外线95％的被角质细胞所吸收。而环境中UVB的增加,无疑会加重对皮肤角质细胞的损伤,引起皮肤的红斑、炎症,甚至皮肤癌等。UVB对DNA有直接的损伤作用,并能诱导细胞发生细胞周期阻滞(Cellcycle arrest)。UVB还是一种重要的氧化应激(Oxidative stress)因素,UVB辐射产生的活化氧簇(Reactive oxygen species,ROS)可破坏皮肤的酶及非酶性抗氧化防御系统,使机体易受损,造成皮肤老化、皮肤肿瘤等病理状态。目前认为ROS在UVB诱导的细胞周期阻滞和凋亡中发挥重要的作用。
研究目的：
UVB被认为是诱发皮肤癌的主要因素,皮肤癌起始于皮肤角质化细胞,因此研究UVB致皮肤角质化细胞损伤的机理具有十分重要的意义。本研究通过观察 UVB辐射对 HaCaT细胞损伤的生物学效应,深入探讨 UVB致皮肤损伤的机理,并与 A431细胞比较,分析不同种类细胞对UVB辐射不同的生物学反应；另外,我们初步探讨红景天苷在 UVB诱导细胞细胞坏死和凋亡中的作用,为皮肤癌的光化学预防和治疗寻找新的天然药物。
研究方法：
1.用不同剂量(0、10、30、50、70、100 J/m2)的UVB分别照射 HaCaT细胞和A431细胞,并继续培养24h后,MTT法检测细胞存活率；用50 J/m2剂量 UVB照射HaCaT细胞和A431细胞后继续培养,在照后不同培养时间(2、4、8、12、24h)使用MTT法检测细胞存活率,观察比较两种细胞存活率的变化。
2.应用流式细胞术检测50 J/m2的UVB照射后培养至12h的 HaCaT细胞和 A431细胞周期的变化,分析 UVB对细胞周期的影响及与凋亡的关系。
3.用RT-PCR和 Western blot法,分别从RNA水平和蛋白水平检测 UVB照射后HaCaT细胞和 A431细胞在不同时间点(2、4、8、12、24h)NF-kB、Bcl-2和CDK6的表达情况,探讨 NF-kB信号通路及相关蛋白在UVB诱导的细胞损伤中的作用。
4.应用 MTT法检测不同浓度(100、300、500μg/ml)红景天苷预处理的 HaCaT细胞和A431细胞在UVB照射后24h的存活率,并与阳性对照组比较,探讨红景天苷的对细胞是否存在保护或者杀伤的药效作用。
研究结果：
1.UVB对HaCaT细胞和A431细胞存活率的影响存在时间依赖性和剂量依赖性,随着 UVB照射剂量的增加,细胞存活率逐渐降低；50 J/m2剂量的UVB照射后随着培养时间的增加,细胞的存活率逐渐降低,但A431细胞在24h时间点的存活率略有回升。在两种细胞之间,不同剂量照射后培养24h的细胞存活率没有显著差异；50 J/m2剂量照射后培养不同时间的MTT结果表明:两种细胞在 UVB照射后4h和8h的存活率没有显著差异(P>0.05),在此之前的2h时间点A431存活率略高于HaCaT细胞(P<0.05),而12h的结果与2h结果相反,HaCaT细胞存活率略高于A431(P<0.05),两种细胞的存活率在24h基本相同。
2.HaCaT细胞经50 J/m2照射后12h发生G0/G1期阻滞,并且出现明显的凋亡峰。而在A431细胞中,细胞周期分布基本没有改变。
3.在HaCaT细胞中,UVB照射能够诱导NF-kB信号通路的激活,上调NF-kB/p65的表达,与对照组相比在8h有显著性差异,并持续高表达至24h,同时UVB照射也能够引起 Bcl-2和CDK6基因的高表达；在A431细胞中有与上述相似的结果。
4.在红景天苷药效学的研究中(红景天苷对 A431细胞和 HaCaT细胞在UVB照射后的影响):对于A431细胞,单纯UVB照射组细胞的存活率低于阳性对照组(P<0.05),UVB促细胞凋亡和坏死作用明显；而阳性对照组和单独用药组之间差异无显著性意义(P>0.05),说明红景天苷药物对细胞没有毒性作用；在50 J/m2 UVB照射并给予不同剂量的红景天苷处理的细胞中,随着红景天苷应用剂量的增加,细胞存活率呈下降趋势,单独照射 UVB组与UVB+500μg/ml红景天苷组有显著性差异(P<0.05),说明红景天苷和UVB的联合应用能够促进细胞凋亡和坏死,降低细胞存活率。红景天苷对 HaCaT细胞亦有类似的作用。红景天苷的这种作用使其有可能成为治疗和预防皮肤癌的新药物。
结论：
1.UVB诱导 HaCaT细胞和A431细胞损伤具有时间依赖性和剂量依赖性,UVB诱导的生物学效应与细胞的种类有关,不同种类细胞对 UVB照射的生物学反应不同。
2.NF—kB信号通路可能参与UVB诱导的细胞损伤应答,并与同样高表达的Bcl-2、CDK6之间存在一定的联系；在A431细胞中有与 HaCaT细胞相似的结果,这些基因和蛋白能够为皮肤癌的治疗提供新的靶点。
3.红景天苷联合UVB照射能够降低细胞存活率,提示红景天苷具有光致敏作用或者其他活性作用,红景天苷有可能成为皮肤癌化学治疗和预防的新药物。