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二氢槲皮素（Dihydroquercetin，DHQ）作为一种重要的黄酮类物质，是一种比较稀缺的天然强效抗氧化剂，可有效去除人体内的自由基与毒素，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和调节免疫力等重要生物活性，是食品、医药和保健品领域的珍贵原料，而植物提取和化学合成的产率较低且不环保。目前，已能利用大肠杆菌和工程酵母等微生物合成二氢黄酮、黄酮、异黄酮、黄酮醇、花色素和黄烷酮等黄酮类化合物，为DHQ的生物合成提供了理论支持。本研究应用合成生物学的方法，在原核和真核表达系统中将DHQ合成途径中的植物源关键基因（F3H、F3’H）进行异源表达，并进行条件优化，最终微生物合成天然产物DHQ。
通过基因筛选和优化后，人工合成具有大肠杆菌密码子偏好性的3种不同植物来源的黄酮3-羟化酶基因（CsF3H、GbF3H、GmF3H）和类黄酮3’-羟化酶基因（CsF3’H、GbF3’H、GmF3’H）以及2种细胞色素P450还原酶基因（ATR、CPR），并分别构建单基因表达载体和多基因共表达载体pETM6-F3H-F3’H-ATR/CPR。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，构建大肠杆菌工程菌。将所有工程菌诱导表达之后，通过SDS-PAGE电泳检测到该工程菌可以表达F3H但不能表达F3’H，通过高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）检测到代谢产物二氢山奈酚但没有检测到次级产物圣草酚和目标产物DHQ。对3种F3H蛋白分离纯化之后进行酶学性质研究，CsF3H重组酶在pH7.5、40℃条件下相对酶活达到最高；GbF3H重组酶在pH7.0、40℃条件下相对酶活达到最高；GmF3H重组酶在pH7.0、35℃条件下相对酶活达到最高，整体上相差不大。比较它们的动力学参数可知，CsF3H蛋白对柚皮素的亲和力最低，但催化效率最高。
同时，人工合成了具有酿酒酵母密码子偏好性的3种不同植物来源的黄酮3-羟化酶基因（CsF3H、GbF3H、GmF3H）和类黄酮3’-羟化酶基因（CsF3’H、GbF3’H、GmF3’H），分别构建单基因酵母表达载体和双基因酵母表达载体，并对双基因酵母表达载体中的F3H基因进行启动子优化（将诱导型启动子GAL10替换为组成型启动子GPD）。将重组质粒转化酿酒酵母WAT11菌株，构建酵母工程菌。工程菌诱导表达后，通过HPLC检测，筛选到4株可以产生DHQ的菌株，其中DHQ的最高产量为437.47μM。
综上，本研究通过基因工程手段成功构建出4株可合成DHQ的酿酒酵母工程菌株，为在微生物体内合成其他黄酮类天然产物提供了参考，具有重要的指导意义。
通过基因筛选和优化后，人工合成具有大肠杆菌密码子偏好性的3种不同植物来源的黄酮3-羟化酶基因（CsF3H、GbF3H、GmF3H）和类黄酮3’-羟化酶基因（CsF3’H、GbF3’H、GmF3’H）以及2种细胞色素P450还原酶基因（ATR、CPR），并分别构建单基因表达载体和多基因共表达载体pETM6-F3H-F3’H-ATR/CPR。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，构建大肠杆菌工程菌。将所有工程菌诱导表达之后，通过SDS-PAGE电泳检测到该工程菌可以表达F3H但不能表达F3’H，通过高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）检测到代谢产物二氢山奈酚但没有检测到次级产物圣草酚和目标产物DHQ。对3种F3H蛋白分离纯化之后进行酶学性质研究，CsF3H重组酶在pH7.5、40℃条件下相对酶活达到最高；GbF3H重组酶在pH7.0、40℃条件下相对酶活达到最高；GmF3H重组酶在pH7.0、35℃条件下相对酶活达到最高，整体上相差不大。比较它们的动力学参数可知，CsF3H蛋白对柚皮素的亲和力最低，但催化效率最高。
同时，人工合成了具有酿酒酵母密码子偏好性的3种不同植物来源的黄酮3-羟化酶基因（CsF3H、GbF3H、GmF3H）和类黄酮3’-羟化酶基因（CsF3’H、GbF3’H、GmF3’H），分别构建单基因酵母表达载体和双基因酵母表达载体，并对双基因酵母表达载体中的F3H基因进行启动子优化（将诱导型启动子GAL10替换为组成型启动子GPD）。将重组质粒转化酿酒酵母WAT11菌株，构建酵母工程菌。工程菌诱导表达后，通过HPLC检测，筛选到4株可以产生DHQ的菌株，其中DHQ的最高产量为437.47μM。
综上，本研究通过基因工程手段成功构建出4株可合成DHQ的酿酒酵母工程菌株，为在微生物体内合成其他黄酮类天然产物提供了参考，具有重要的指导意义。