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乙醇酸氧化酶(Glycolate oxidase,简称GLO)是光呼吸代谢的关键酶。生物信息学分析表明水稻基因组中有共六个GLO的相似序列,分别位于三号、四号、七号、和八号染色体上,其中四号和八号染色体的两个序列的起始密码子还没有被识别。本实验室在前期的研究中,通过RNAi技术和超表达技术分别构建了GLO1,GLO3,GLO4,GLO5等四个基因的组成型干涉,以及过表达的水稻转基因植株。初步的研究结果表明,GLO1和GLO4可能是GLO家族中的关键成员,在光呼吸代谢途径中起着重要作用,其生理功能还有待于进一步的分析和研究。
本研究以转录水平调控比较理想的两个GLO4组成型干涉株系为研究材料,探讨了GLO4表达下调对光合作用的影响及其调控光合作用的机制。研究结果表明,GLO4被干涉后,GLO活性大幅降低;测定乙醇酸和乙醛酸含量发现,GLO活性下调80％和85%的转基因植株内的乙醇酸含量比野生型的分别提高了4倍和9倍,而乙醛酸的含量没有明显差异。光合速率的测定结果表明,转基因植株的净光合速率明显下降;光强响应曲线和CO2浓度响应曲线的测定结果显示,转基因植株对光强和CO2浓度变化的反应比野生型迟钝,说明GLO4表达受抑制的转基因植株的光合作用确实受到了影响。
通过半定量和荧光定量RT-PCR分析光合作用中的关键基因Rubisco活化酶(RCA)的表达情况发现,转基因植株中RCA基因在转录水平的表达受到明显抑制,而其在翻译水平的表达却无变化。为验证乙醇酸的积累是否对RCA起到了调控作用,我们克隆得到了RCA翻译起始位点上游约2Kb的启动子调控序列,并构建了RCAP::GFP表达载体。通过原生质体瞬时表达技术研究不同浓度乙醇酸对RCA启动子活性的调控作用,结果表明乙醇酸并没有影响RCA启动子的活性;另外,外源施加不同浓度乙醇酸对水稻和烟草叶片进行处理,分析内源RCA表达的变化,结果亦显示乙醇酸并没有影响RCA在转录水平的表达。
综合以上实验结果认为,GLO4干涉后引起了GLO活性下调,影响了水稻的光合作用,但没有破坏水稻的光合机构;乙醇酸的积累可能并没有抑制RCA的表达从而降低光合速率。GLO4调控光合作用可能是一个复杂而精细的过程,其机理还有待于进一步的研究和探讨。