论文部分内容阅读
蝴蝶兰(Phalaenopsis)为单子叶附生兰，其花型优美，花序排列整齐，花期长，是兰科植物中栽培最广泛、最受欢迎的种类之一。虽然蝴蝶兰在传统的育种方式上可获得许多优良品种，但仍有一些性状仅仅依靠传统育种手段则难以取得较快的突破。本研究以‘小男孩’、‘红宝石’、‘台湾阿妈’和RPL-05为材料，建立蝴蝶兰快速繁殖体系，并在此基础上初步建立了RPL-05以农杆菌介导的遗传转化体系，主要结果如下：
(1)以花梗腋芽诱导营养芽建立了快繁无菌体系，获得大量无菌材料。不同的取材部位对花梗腋芽的萌芽率有明显差异，‘小男孩’和‘红宝石’中部腋芽萌芽率可达到100％。综合丛芽增殖、褐化和生长情况等来看，无机盐、细胞分裂素、添加物等在培养过程中均有一定影响，‘小男孩’、‘红宝石’和‘台湾阿妈’三个品种在1/2MS+6BA 5.0-7.0mg/L+NAA 0.5mg/L+椰子汁200 ml/L+柠檬酸100 mg/L+蔗糖20 g，L+琼脂8g/L，pH=5.2-5.4的培养基中，繁殖系数均达到3.0以上。活性炭和有机添加物对‘小男孩’、‘台湾阿妈’和‘红宝石’的出根有不同程度的促进作用，在添加1mg/活性炭的培养基中，‘小男孩’和‘台湾阿妈’的出根率分别达到96.29％和72.72％。
(2)适合RPL-05叶片诱导PL,Bs的细胞分裂素为TDZ，TDZ浓度为0.5 mg/L时效果最好，叶片的PLBs诱导率和每个叶段平均诱导数分别达到68％和11.15。TDZ浓度、蔗糖浓度、切割方式和接种密度等对PL,Bs块诱导新PL,Bs均有影响，以切除茎顶1/3-1/2的PLBs块为诱导材料、TDZ0.1 mg/L、蔗糖20 g，L和20块，瓶的接种密度，PLBs的诱导率和增殖倍数最高分别可达100％和28.17，新诱导的PLBs整齐，生长正常，大小为2.0-4.0mm。活性炭和有机添加物对RPL-05 PLBs分化率和出根率有不同程度的促进作用，其中番木瓜汁的作用最好，分别达到94.44％和83.33％。
(3)以载体携带的hptⅡ为抗生素筛选标记，选Cef为防止农杆菌污染的抗生素。结果表明RPL-05材料对Hyg很敏感，但处于不同形态分化阶段敏感程度有所差异，诱导阶段适宜浓度为10mg/L浓度；分化阶段适宜浓度为5-8mg/L；根对Hyg最为敏感，出根阶段不加为宜。综合Cef对材料生长与发育的影响和Cef抑制农杆菌的实验结果，Cef适宜浓度为200 mg/L。
(4)分别以受体的创伤方式、预培养时间、AS浓度、工程菌液浓度(OD600)、浸染时间、共培养时间来测试应用农杆菌介导法转化RPL-05 PLBs的效率，对转化条件进行优化。结果表明，以注射器针尖针刺切除1/3-1，2茎顶的PLBs块表面为创伤方式，预培养时间、浸染时间和共培养时间分别为4-5 d、90 min和3-4 d，菌液OD600为0.5，AS浓度为100μmol/L时GUS瞬时表达率达到最高，为34.48％。
(5)以获得的最佳转化条件对3100个受体进行转化，获得抗性原球茎和芽；改良SDS法有较高的DNA得率，能满足PCR扩增的需要；对抗性材料进行PCR检测，其中PCR阳性材料有2个单芽和4丛PLBs，初步证明了外源APD基因己整合到抗性材料的基因组中。