论文部分内容阅读
辣椒(CapsicumannuumL.)是大宗蔬菜之一，既有较高的营养价值，也具一定的药用价值，更是喜食辣椒者不可或缺的调味品。辣椒杂种优势非常明显，有些优良组合比传统主栽品种增产30％-50％，早期产量增产50％以上。辣椒杂种一代已广泛应用于生产，并取得了明显的经济效益。但目前大量应用的辣椒杂交种子均是通过人工去雄制成的，制种成本高，种子价格昂贵，雄性不育系的利用是迄今为止有可能降低辣椒制种成本最有效的途径。获得雄性不育系及其恢复系是杂种优势利用的关键。虽然用常规育种方法获得了雄性不育材料，但还有许多问题，如恢复材料难以找到，恢复性状的转育很麻烦等。因此，通过基因工程创造雄性不育系及其恢复系将会大大促进辣椒杂交种子的生产。Cre-loxp是来源于噬菌体PI.的一种位点特异性重组系统。目前，它己广泛应用于基因功能鉴定，动植物及微生物基因组的修饰以及基因的表达和调控。它的应用能够简化制种程序，降低种子成本，提高种子纯度，带来更大的经济效益。本实验就是以Cre-loxp系统调控细胞毒素基因Barnase在雄性器官发育的特异时期在特异组织表达，从而达到控制其育性的目的，这也是本研究的创新之处。辣椒基因工程研究虽然已取得了一定的成就，但进展缓慢，主要原因是辣椒离体再生困难，遗传转化率太低。本研究较系统地研究了影响辣椒再生的各种主要因素(基因型、外植体类型和培养基等)，建立了重复性较好的辣椒高效离体再生体系，通过农杆菌介导以Cre基因和位于loxp之间的Barnase基因转化辣椒，获得了一定量的转基因植株。
主要结果如下：
1.通过调整培养基中的几种生长调节剂种类浓度及其配比和添加物，建立了较理想的以带柄子叶为外植体的辣椒高效离体再生体系。选用辣椒9～11d苗龄的带柄子叶在培养基MB(MS矿质元素+B5有机)+BA5.0mg/L+IAA1.0mg/L+GA31.0mg/L+蔗糖3％+琼脂6.5g/L+椰乳5％+AgNO35.0mg/L上培养，分化频率最高可达97.8％，每个外植体可分化形成1～2个不定芽丛；不定芽丛在MB+ZT1.0mg/L+IAA1.0mg/L+GA31.5mg/L+椰乳5％+AgNO35.0mg/L培养基上伸长率最高可达76.0％；幼苗在MS+IAA0.1mg/L+NAA0.2mg/L培养基上能正常生根，生根率最高达100％,最后能长成健壮的再生植株。
2.用农杆菌介导法将Barnase基因和Cre基因导入辣椒中：取苗龄为9～11d的辣椒带柄子叶为外植体，在预培养基(MB+BA5.0mg/L+IAA1.0mg/L+GA31.0mg/L+3％蔗糖+琼脂6.5g/L)上预培养2d；OD600值为0.6～0.9的菌液中浸染12～16min，共培养基(预培养基+AS200μM)上培养4～5d；转入选择分化培养基(MB+BA5.0mg/L+IAA1.0mg/L+GA31.0mg/L+AgNO35.0mg/L+椰乳5％+Km65mg/L+Cb500mg/L+3％蔗糖+琼脂6.5g/L(pH5.8)中培养，获得的抗性芽丛在选择伸长培养基(MB+ZT1.0mg/L+IAA1.0mg/L+GA31.5mg/L+AgNO33.0mg/L+椰乳5％+Cb500mg/L+Km65mg/L)中伸长，于生根培养基(MS+0.1mg/LIAA+0.2mg/LNAA+Cb125mg/L)中生根。A、D、E和I四个品种都获得了一定数量的经卡那霉素筛选的抗性苗。
3.对抗性苗进行PCR和Southern杂交表明部分植株外源基因已经整合到辣椒基因组DNA。各品种(系)转Cre基因和Barnase基因PCR阳性率是：品种(系)A35.6％、81.3％，D64.7％、52.4％，E38.5％、60.0％及I38.9％、44.4％；各品种(系)转Cre基因和Barnase基因southern杂交阳性率是：品种(系)A56.3％、38.5％，D27.3％、20.0％，E13.3％、66.7％及I42.9％、0；转Cre基因植株生长发育正常，能正常开花结果；转Barnase基因植株生长正常，花外观形态正常，但花粉出现完全败育、部分可育，全可育3种情况。进一步的筛选和杂交工作正在进行。