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滇桂艾纳香是壮族民间药和广西特色名优妇科止血中成药“妇血康”的单方植物。虽然“妇血康”以独特的疗效畅销全国,但至今仍存在药理活性成分不明,作用机制不清,质量标准不完善等问题。基于此情况,本文以滇桂艾纳香为原料,对其止血的药理活性物质基础、质量控制方法、止血机理以及活性物质的构效展开研究。 (1)止血的药理活性物质基础研究 滇桂艾纳香乙酸乙酯部分通过色谱层析技术以及重结晶方法,分离鉴定了10个化合物。通过理化性质分析和波谱解析为:二十八碳烷酸(1)、2,6-二甲氧基对苯醌(2)、5,7,4-三羟基-3,5-二甲氧基黄酮(3)、香草酸(4)、丁香酸(5)、BlumeaxantheneⅡ(6)、对苯二酚(7)、对香豆酸(8)、原儿茶酸(9)、咖啡酸(10)。其中(1),(2),(3),(8)首次从该植物中分离得到。(6)为天然植物界中罕见的含氯元素的氧杂蒽化合物,并提出了该物质的生物合成途径。 采用HPLC/MS技术分离鉴定了滇桂艾纳香中的酚酸类物质16个和黄酮类物质两个,它们为:新绿原酸(5-CQA)、绿原酸(3-CQA)、隐绿原酸(4-CQA)、咖啡酸(COA)、1,3-二咖啡酰奎尼酸(1,3-diCQA)、3,4-二咖啡酰奎尼酸(3,4-diCQA)、1,5-二咖啡酰奎尼酸(1,5-diCQA)、3,5-二咖啡酰奎尼酸(3,5-diCQA)、4,5-二咖啡酰奎尼酸(4,5-diCQA),阿魏酰奎宁酸同分异构体两个,Caffeoylferuloylquinic acid同分异构体三个,三咖啡酰奎尼酸一个、Dicaffeoylferuloylquinic acid一个以及Meamsetin-glu、Isorhamnetin-glu两个黄酮类化合物。其中17个化合物(除COA外)为滇桂艾纳香植物中首次报道。 (2)质量控制方法研究 采用了反相高效液相色谱法建立了同时测定滇桂艾纳香5-CQA、3-CQA、4-CQA、COA、3,4-diCQA及4,5-diCQA六种酚酸的方法。结果表明:六种酚酸线性范围分别为4~20、10~50、10~50、4~20、60~300、50~250以及40~200μg/ml;最低定量限分别为0.8、2、2、1、4和4μg/ml;回收率范围在98.6±7.53%~105.1±4.22%之间;日内和日间保留时间RSD分别0.01~0.06%和0.03~0.21%;日内和日间峰面积RSD分别为0.03~2.35%和0.45~3.04%;样品中酚酸在24h的变化率RSD为0.12%~1.86%;样品中酚酸重复性RSD在0.55%~1.80%。在滇桂艾纳香中,4-CQA、3,4-diCQA和4,5-diCQA含量丰富,其含量分别为:2.048±0.002、3.507±0.013和2.433±0.026mg·g-1。应用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)研究测定了滇桂艾纳香中的14种无机元素Ca、Mg、Fe、Mn、Ni、Cu、Na、Zn、V、Al、Mo、Sr、Ba和B,微量元素的检出限在0.001-0.10μgml-1之间,实验精密度在RSD为0.62%-3.76%。滇桂艾纳香中既含有Ca、Mg、Zn,Fe和V等对于止血过程有影响的元素,而且含有丰富的Mn、Al等微量元素。HPLC法和ICP-AES分别用于控制滇桂艾纳香质量中酚酸和无机元素具有简便、快速特点,且具有较好的精密度和准确度,为滇桂艾纳香的质量评价和质量标准的建立提供理论依据。 (3)止血机理研究 采用断尾实验(BT)、凝血实验(CT)、离体子宫实验、血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、血浆复钙实验模型(RT)对滇桂艾纳香中酚酸类以及结构相似的15种酚酸止血机理进行了探讨。 研究结果表明:滇桂艾纳香的乙酸乙酯部分是滇桂艾纳香的主要活性部位,能显著地减少CT和BT。在这部分,含有的对香豆酸能显著降低CT,APTT,原儿茶酸能显著降低APTT以及加快小鼠子宫收缩频率,两者通过内源凝血途径发挥止血作用。香草酸也是滇桂艾纳香的促凝物质,能显著缩短PT是通过外源凝血途径发挥促凝活性的。丁香酸和阿魏酸能够显著的缩短APTT。绿原酸、咖啡酸具有明显兴奋子宫活动作用,是通过加强子宫活动发挥止血作用。因此,滇桂艾纳香中的对香豆酸、原儿茶酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸和阿魏酸协同止血,是通过内源与外源凝血途径激活凝血因子,以及加强子宫活动,共同发挥促凝活性作用。 根据对小鼠离体子宫平滑肌的作用和对RT的影响,15种酚酸可以分为四类:①具有兴奋子宫活动和抗凝作用的物质,其中绿原酸具有统计学意义(p<0.05);②具有兴奋子宫活动和促凝作用的物质,主要是原儿茶酸(p<0.05),没食子酸;③具有抑制子宫活动和抗凝作用的物质,其中对苯二酚作用显著(p<0.05)④具有抑制子宫活动和促凝作用的物质,其中肉桂酸、香草酸作用显著(p<0.05)。以桂皮酸为母核的酚酸类化合物多数具有促进子宫收缩和抗凝活性。以苯甲酸为母核的酚酸类化合物多具有促进子宫收缩和促凝活性。滇桂艾纳香含有的原儿茶酸、香草酸及绿原酸等酚酸类对子宫收缩和血浆凝集具有双向调节活性,参与止血活血过程。 (4)构效关系研究(QSAR) 研究了绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、香草酸、丁香酸、原儿茶酸、对苯二酚、苯甲酸、对羟基苯甲酸、没食子酸、肉桂酸的抗菌活性和抗氧化作用。采用的方法为肉汤稀释法,菌种为金黄色葡萄球以及脂质过氧化实验。结果表明:对苯二酚的抑菌效果最好,MIC为0.26mg/mL,没食子酸的抗氧化活性最强,IC50为9.41×10-5g/ml。用杂化密度泛函B3LYP方法在6-311++G**基组水平上全优化得到了酚酸类化合物分子几何构型和电子结构,采用逐步多元线性回归法建立了抗菌定量构效关系(QSAR)方程:Log(MIC)=-6.069O-0.4635Elect+7.192LOGMW-9.599和抗氧化作用QSAR方程:-Log(IC50)=-2.635LogP+8.221Hard-9.209LOGMW+61.84;抗菌作用的QSAR反应出椭圆度越大,电负性越大,分子量越小,其该化合物的MIC越小(r=0.9542,SD=0.1034)。其抗氧化的QSAR反应出的疏水常数越大,硬度越小,分子量越大,则-Log(IC50)越小(r=0.9495,SD=0.2487)。两者的实验数据与模型的预测数据接近,其相关性分别为0.9103和0.9015,表明所得的模型有较强的预报能力。