论文部分内容阅读
弧菌病是水产动物最主要的细菌病之一，其爆发性强，死亡率高，每年给我国水产养殖业造成重大经济损失。目前细菌性病害的防治主要依靠抗生素及化学药物。然而，抗生素的大量盲目地使用，导致了耐药性菌株不断出现，使病害更加难以控制，因此需要不断地寻找新的、安全的抗菌药物。 类异戊二烯是弧菌合成细胞壁结构单元肽聚糖的骨架分子，也是参与能量代谢等多种生物过程的十分重要的生理活性物质。生物体内的类异戊二烯类化合物主要有两种生物合成途径:甲羟戊酸(MVA)途径和2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径，其中MEP途径广泛存在于大多数细菌、藻类、地衣及高等植物中，但目前该途径尚未在人体和动物体中发现，因此MEP途径的关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)成为潜在的、具有较好选择毒性的抗弧菌药物的分子靶点。 本研究以创伤弧菌MEP途径中的关键酶DXS及DXR为研究对象，通过分子生物学方法，构建了创伤弧菌DXS和DXR蛋白的表达载体;优化了蛋白的表达条件，获得了可溶性表达的VvDXS和VvDXR蛋白;采用亲和层析法对表达产物VvDXS和VvDXR进行了纯化，获得了两个具有天然酶活性的可溶性蛋白;建立了VvDXS和VvDXR的酶活测定体系，并对反应温度、缓冲液pH、底物浓度、反应酶量等条件进行了优化;在上述基础上建立了VvDXR抑制剂的筛选体系，构建了靶向VvDXS和VvDXR的VvDXS-VvDXR抑制剂高通量筛选模型并评价了模型的可行性;应用VvDXS-VvDXR偶联模型对57个化合物进行了筛选，得到了个1个VvDXR抑制剂，经抗弧菌活性评价获得了1个具有抗弧菌活性的馏分，编号为170-1。